Abstract: Mezenhimālās cilmes šūnas ir pluripotentu cilmes šūnu apakškopa, ko var izolēt no mezodermas.Pateicoties pašreplikācijas atjaunošanai un daudzvirzienu diferenciācijas īpašībām, tiem ir augsts potenciāls dažādām terapijām medicīnā.Mezenhimālajām cilmes šūnām ir unikāls imūnfenotips un imūnregulācijas spēja.Tāpēc mezenhimālās cilmes šūnas jau tiek plaši izmantotas cilmes šūnu transplantācijā, audu inženierijā un orgānu transplantācijā.Papildus šiem lietojumiem tie tiek izmantoti kā ideāls rīks audu inženierijā kā sējšūnas vairākos pamata un klīniskajos pētījumos.Līdz šim nav plaši pieņemtas metodes un standarta mezenhimālo cilmes šūnu kvalitātes kontrolei.Countstar Rigel var uzraudzīt koncentrāciju, dzīvotspēju un fenotipu īpašības (un to izmaiņas) šo cilmes šūnu ražošanas un diferenciācijas laikā.Countstar Rigel ir arī priekšrocība iegūt papildu morfoloģisku informāciju, ko nodrošina pastāvīgi spilgti lauka un fluorescences attēlu ieraksti visā šūnu kvalitātes uzraudzības procesā.Countstar Rigel piedāvā ātru, izsmalcinātu un uzticamu metodi cilmes šūnu kvalitātes kontrolei.
Materiāli un metodes:
No taukiem iegūtās mezenhimālās cilmes šūnas (AdMSC) apdāvināja profesors Nianmin Qi, AO / PI krāsošanas šķīdumu (Shanghai RuiYu, CF002).Antivielas: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD uzņēmums).
AdMSC tika kultivēti 37 ℃, 5% CO2 mitrinātā inkubatorā.Pirms lietošanas sagremot ar tripsīnu.
CD marķiera krāsošanas procedūra tika ievērota kā antivielu rokasgrāmata.
CD marķiera noteikšana ar Countstar Rigel:
1. Tika izveidota signāla krāsu pielietošanas procedūra, iestatot PE kanālu attēla PE fluorescenci.
2. No katras kameras tika uzņemti 3 lauki.
3. Pēc attēlveidošanas un sākotnējās analīzes pabeigšanas sliekšņa (loga vārtu) iestatījums pozitīvai un negatīvai transfekcijai tika iestatīts ar FCS programmatūru.
Cilmes šūnu kvalitātes kontrole
Nākamajā attēlā (1. attēls) parādīta procedūra cilmes šūnu terapija .
1. attēls. Cilmes šūnu terapijas procedūra
Rezultāti:
AdMSC koncentrācijas, dzīvotspējas, diametra un agregācijas noteikšana.
AdMSC dzīvotspēja tika noteikta ar AO / PI, tika izveidota divu krāsu pielietošanas procedūra, iestatot Zaļo kanālu un Sarkano kanālu attēla AO un PI fluorescencei, kā arī spilgtu lauku.Attēlu piemēri ir parādīti 2. attēlā.
2. attēls. AdMSC attēli pirms transportēšanas un pēc transportēšanas.A. Pirms transportēšanas;tiek parādīts reprezentatīvs attēls.B. Pēc transportēšanas;tiek parādīts reprezentatīvs attēls.
AdMSC dzīvotspēja pēc transportēšanas tika krasi mainīta, salīdzinot ar pirms transportēšanas.Dzīvotspēja pirms transportēšanas bija 92%, bet pēc transportēšanas tā samazinājās līdz 71%.Rezultāts tika parādīts 3. attēlā.
3. attēls. AdMSC dzīvotspējas rezultāti (pirms transportēšanas un pēc transportēšanas)
Diametru un agregāciju noteica arī Countstar Rigel.AdMSC diametrs tika krasi mainīts pēc transportēšanas, salīdzinot ar pirms transportēšanas.Diametrs pirms transportēšanas bija 19 µm, bet pēc transportēšanas tas palielinājās līdz 21 µm.Pirms transportēšanas summējums bija 20%, bet pēc transportēšanas tas pieauga līdz 25%.No Countstar Rigel uzņemtajiem attēliem AdMSC fenotips pēc transportēšanas tika krasi mainīts.Rezultāti tika parādīti 4. attēlā.
4. attēls. Diametrs un apkopojuma rezultāti.A: AdMSC reprezentatīvie attēli, AdMSC fenotips pēc transportēšanas tika krasi mainīti.B: Agregācija pirms transportēšanas bija 20%, bet pēc transportēšanas tā pieauga līdz 25%.C: diametrs pirms transportēšanas bija 19 µm, bet pēc transportēšanas tas palielinājās līdz 21 µm.
Countstar Rigel nosakiet AdMSC imūnfenotipu
AdMSC imūnfenotipu noteica Countstar Rigel, AdMSC tika inkubēti attiecīgi ar dažādām antivielām (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Signāla krāsu pielietošanas procedūra tika izveidota, iestatot zaļo kanālu attēla PE fluorescencei, kā arī spilgtu lauku.Spilgta lauka attēla atsauces segmentācija tika izmantota kā maska PE fluorescences signāla paraugu ņemšanai.Tika parādīti CD105 rezultāti (5. attēls).
5. attēls. AdMSC CD105 rezultātus noteica Countstar Rigel.A: CD105 pozitīvā procentuālā daudzuma kvantitatīvā analīze dažādos paraugos, izmantojot FCS express 5 plus programmatūru.B: augstas kvalitātes attēli sniedz papildu morfoloģisko informāciju.C: apstiprināti rezultāti, izmantojot katras šūnas sīktēlus, FCS programmatūras rīki sadalīja šūnas dažādās grupās atbilstoši to dažādajai proteīna ekspresijai.
Citu antivielu rezultāti ir parādīti 6. attēlā
6. attēls: A: reprezentatīvs ASC attēls ar tipisku vārpstas formas morfoloģiju.Uzņemts ar OLYMPUS mikroskopu.Oriģinālais palielinājums, (10x).B: ASC adipogēno diferenciāciju apliecina rutēnija sarkanā krāsošana, kas parāda mineralizācijas apgabalus.Uzņemts ar OLYMPUS mikroskopu.Oriģinālais palielinājums (10x).C: Countstar FL ASC raksturojums.
Kopsavilkums:
Countstar FL var uzraudzīt koncentrāciju, dzīvotspēju un fenotipu īpašības (un to izmaiņas) šo cilmes šūnu ražošanas un diferenciācijas laikā.FCS express nodrošina funkciju, lai pārskatītu katru signāla šūnu, apstiprinātu datus, izmantojot attēlu.Lietotājam var būt arī pārliecība veikt nākamos eksperimentus, pamatojoties uz Countstar Rigel rezultātiem.Countstar Rigel piedāvā ātru, izsmalcinātu un uzticamu metodi cilmes šūnu kvalitātes kontrolei.
