Perifēro asiņu mononukleārās šūnas (PBMC) bieži tiek apstrādātas, lai tās atdalītu no pilnām asinīm ar blīvuma gradienta centrifugēšanu.Šīs šūnas sastāv no limfocītiem (T šūnām, B šūnām, NK šūnām) un monocītiem, ko parasti izmanto imunoloģijas, šūnu terapijas, infekcijas slimību un vakcīnu izstrādes jomā.PBMC dzīvotspējas un koncentrācijas uzraudzība un analīze ir ļoti svarīga klīniskajām laboratorijām, fundamentālajiem medicīnas zinātnes pētījumiem un imūnšūnu ražošanai.
1. attēls. Izolēts PBMC no svaigām asinīm ar blīvuma gradienta centrifugēšanu
AOPI Dual-fluoresces skaitīšana ir testa veids, ko izmanto šūnu koncentrācijas un dzīvotspējas noteikšanai.Šķīdums ir akridīna oranža (zaļi fluorescējoša nukleīnskābes traipa) un propīdija jodīda (sarkanā fluorescējošā nukleīnskābes traipa) kombinācija.Propīdija jodīds (PI) ir membrānas izslēdzoša krāsviela, kas nonāk tikai šūnās ar bojātām membrānām, savukārt akridīna apelsīns spēj iekļūt visās populācijas šūnās.Ja kodolā ir abas krāsvielas, propīdija jodīds samazina akridīna oranžās fluorescences fluorescences rezonanses enerģijas pārnesi (FRET).Rezultātā kodola šūnas ar neskartām membrānām iekrāsojas fluorescējoši zaļā krāsā un tiek uzskatītas par dzīvām, savukārt kodola šūnas ar bojātām membrānām krāso tikai fluorescējošu sarkanu krāsu un tiek uzskatītas par mirušām, izmantojot Countstar® FL sistēmu.Materiāli bez kodoliem, piemēram, sarkanās asins šūnas, trombocīti un atkritumi nefluorescē, un Countstar® FL programmatūra tos ignorē.
Eksperimentāla procedūra:
1.PBMC paraugu atšķaida 5 dažādās koncentrācijās ar PBS;
2. Pievienojiet 12 µl AO/PI šķīduma 12 µl paraugam, viegli sajaucot ar pipeti;
3. Ievelciet 20 µl maisījuma kameras priekšmetstikliņā;
4. Ļaujiet šūnām nosēsties kamerā apmēram 1 minūti;
5.Ievietojiet priekšmetstikliņu Countstar FL instrumentā;
6. Izvēlieties “AO/PI Viability” testu un pēc tam pārbaudiet ar Countstar FL.
Uzmanību: AO un PI ir potenciāli kancerogēni.Operatoram ieteicams lietot individuālos aizsardzības līdzekļus (IAL), lai izvairītos no tiešas saskares ar ādu un acīm.
Rezultāts:
1. PBMC gaišā lauka un fluorescences attēli
Gan AO, gan PI krāsviela krāso DNS šūnu šūnu kodolā.Tāpēc trombocīti, sarkanās asins šūnas vai šūnu atliekas nespēj ietekmēt PBMC koncentrāciju un dzīvotspējas rezultātu.Dzīvās šūnas, atmirušās šūnas un gružus var viegli atšķirt, pamatojoties uz Countstar FL ģenerētajiem attēliem (1. attēls).
2. attēls. PBMC gaišā lauka un fluorescences attēli
2. PBMC koncentrācija un dzīvotspēja
PBMC paraugus atšķaida 2, 4, 8 un 16 reizes ar PBS, pēc tam šos paraugus inkubēja ar AO / PI krāsvielu maisījumu un attiecīgi analizēja ar Countstar FL.PBMC koncentrācijas un dzīvotspējas rezultāts ir parādīts zemāk attēlā:
