Захын цусны мононуклеар эсүүд (PBMCs) нь ихэвчлэн нягтралын градиент центрифугийн аргаар бүхэл цуснаас салгахын тулд боловсруулагддаг.Эдгээр эсүүд нь дархлаа судлал, эсийн эмчилгээ, халдварт өвчин, вакцин боловсруулахад өргөн хэрэглэгддэг лимфоцитууд (Т эсүүд, В эсүүд, NK эсүүд) ба моноцитуудаас бүрддэг.PBMC-ийн амьдрах чадвар, концентрацийг хянах, шинжлэх нь эмнэлзүйн лаборатори, анагаахын шинжлэх ухааны суурь судалгаа, дархлааны эсийн үйлдвэрлэлд маш чухал юм.
Зураг 1. Нягтын градиент центрифуг бүхий шинэ цуснаас тусгаарлагдсан PBMC
AOPI Хос флюресцент тоолох нь эсийн концентраци болон амьдрах чадварыг илрүүлэхэд ашигладаг шинжилгээний төрөл юм.Уг уусмал нь акридин жүрж (ногоон флюресцент нуклейн хүчлийн толбо) ба пропидиум иодид (улаан флюресцент нуклейн хүчлийн толбо) -ийн хослол юм.Propidium iodide (PI) нь зөвхөн мембраны гэмтэлтэй эсүүдэд нэвтэрдэг, харин акридин жүрж нь популяцийн бүх эсийг нэвтлэх чадвартай байдаг.Цөмд будагч бодис хоёулаа байх үед пропидиум иодид нь флюресценцийн резонансын энергийн дамжуулалтаар (FRET) акридины улбар шар өнгийн флюресценцийг бууруулдаг.Үүний үр дүнд бүрэн мембрантай цөмт эсүүд нь флюресцент ногоон өнгөөр будаж, амьд гэж тооцогддог бол мембран нь гэмтсэн цөмт эсүүд зөвхөн флюресцент улаанаар будаж, Countstar® FL системийг ашиглах үед үхсэнд тооцогддог.Цусны улаан эс, ялтас, хог хаягдал гэх мэт бөөмгүй материал нь флюресцент үүсгэдэггүй бөгөөд Countstar® FL програм хангамжид үл тоомсорлодог.
Туршилтын журам:
1. PBMC дээжийг PBS-ээр 5 өөр концентрацид шингэлнэ;
2. 12μl AO/PI уусмалыг 12μl дээжинд нэмж, пипеткээр зөөлөн холино;
3. Тасалгааны слайд руу 20 мкл хольцыг зурах;
4. Эсийг камерт 1 минут орчим байлгана;
5. Countstar FL багаж руу слайдыг шавьж;
6. “AO/PI Viability” шинжилгээг сонгоод дараа нь Countstar FL-ээр шалгана уу.
Анхааруулга: AO болон PI нь хорт хавдар үүсгэгч бодис юм.Оператор арьс, нүдтэй шууд харьцахаас зайлсхийхийн тулд хувийн хамгаалалтын хэрэгсэл (PPE) өмсөхийг зөвлөж байна.
Үр дүн:
1. PBMC-ийн тод талбайн болон флюресценцийн зураг
AO болон PI будаг нь эсийн эсийн цөм дэх ДНХ-г толбо үүсгэдэг.Тиймээс ялтас, цусны улаан эс эсвэл эсийн хог хаягдал нь PBMC-ийн концентраци болон амьдрах чадварт нөлөөлөх боломжгүй юм.Countstar FL-ийн үүсгэсэн зураг дээр үндэслэн амьд эс, үхсэн эс, хог хаягдлыг хялбархан ялгаж болно (Зураг 1).
Зураг 2．PBMC-ийн тод талбайн болон флюресценцийн зураг
2.ПБМЗ-ийн агууламж ба амьдрах чадвар
PBMC дээжийг PBS-ээр 2, 4, 8, 16 удаа шингэлж, дараа нь тэдгээр дээжийг AO/PI будгийн хольцоор өсгөвөрлөж, Countstar FL тус тус шинжилэв.PBMC-ийн концентраци ба амьдрах чадварын үр дүнг дараах зурагт үзүүлэв.
