पेरिफेरल ब्लड मोनोन्यूक्लियर सेल्स (PBMCs) वर अनेकदा घनता ग्रेडियंट सेंट्रीफ्यूगेशनद्वारे संपूर्ण रक्तापासून विभक्त होण्यासाठी प्रक्रिया केली जाते.त्या पेशींमध्ये लिम्फोसाइट्स (टी पेशी, बी पेशी, एनके पेशी) आणि मोनोसाइट्स असतात, ज्याचा वापर सामान्यतः रोगप्रतिकारकशास्त्र, सेल थेरपी, संसर्गजन्य रोग आणि लस विकासाच्या क्षेत्रात केला जातो.क्लिनिकल प्रयोगशाळा, मूलभूत वैद्यकीय विज्ञान संशोधन आणि रोगप्रतिकारक पेशींच्या उत्पादनासाठी PBMC ची व्यवहार्यता आणि एकाग्रतेचे निरीक्षण आणि विश्लेषण करणे महत्वाचे आहे.
अंजीर 1. घनता ग्रेडियंट सेंट्रीफ्यूगेशनसह ताज्या रक्तापासून अलग केलेले पीबीएमसी
AOPI ड्युअल-फ्लोरेसेस मोजणी हा सेल एकाग्रता आणि व्यवहार्यता शोधण्यासाठी वापरला जाणारा परख प्रकार आहे.अॅक्रिडाइन ऑरेंज (हिरवा-फ्लोरोसंट न्यूक्लिक अॅसिड डाग) आणि प्रोपिडियम आयोडाइड (लाल-फ्लोरोसंट न्यूक्लिक अॅसिड डाग) यांचे मिश्रण आहे.प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआय) हा एक झिल्ली अपवर्जन रंग आहे जो केवळ तडजोड केलेल्या पडद्याच्या पेशींमध्ये प्रवेश करतो, तर ऍक्रिडाइन ऑरेंज लोकसंख्येतील सर्व पेशींमध्ये प्रवेश करण्यास सक्षम आहे.जेव्हा दोन्ही रंग न्यूक्लियसमध्ये उपस्थित असतात, तेव्हा प्रोपिडियम आयोडाइड फ्लूरोसेन्स रेझोनान्स एनर्जी ट्रान्सफर (FRET) द्वारे ऍक्रिडाइन ऑरेंज फ्लोरोसेन्समध्ये घट घडवून आणते.परिणामी, अखंड झिल्ली असलेल्या न्यूक्लिएटेड पेशी फ्लोरोसेंट हिरव्या रंगाच्या असतात आणि त्यांना सजीव म्हणून गणले जाते, तर तडजोड केलेल्या झिल्ली असलेल्या न्यूक्लिएटेड पेशी केवळ फ्लोरोसेंट लाल डाग करतात आणि Countstar® FL प्रणाली वापरताना मृत म्हणून गणले जातात.लाल रक्तपेशी, प्लेटलेट्स आणि मोडतोड यांसारखी केंद्रक नसलेली सामग्री फ्लोरोसेस होत नाही आणि Countstar® FL सॉफ्टवेअरद्वारे दुर्लक्ष केले जाते.
प्रायोगिक पद्धत:
1. PBMC नमुना PBS सह 5 वेगवेगळ्या एकाग्रतेमध्ये पातळ करा;
2. 12µl नमुन्यात 12µl AO/PI द्रावण जोडा, हलक्या हाताने पिपेटमध्ये मिसळा;
3. चेंबर स्लाइडमध्ये 20µl मिश्रण काढा;
4. पेशींना सुमारे 1 मिनिटासाठी चेंबरमध्ये स्थिर होऊ द्या;
5. काउंटस्टार FL इन्स्ट्रुमेंटमध्ये स्लाइडची कीटक करा;
6. "AO/PI व्यवहार्यता" परख निवडा, नंतर Countstar FL द्वारे चाचणी करा.
खबरदारी: AO आणि PI हे संभाव्य कार्सिनोजेन आहे.त्वचा आणि डोळ्यांचा थेट संपर्क टाळण्यासाठी ऑपरेटरने वैयक्तिक संरक्षणात्मक उपकरणे (PPE) घालण्याची शिफारस केली जाते.
परिणाम:
1. PBMC च्या ब्राइट फील्ड आणि फ्लोरोसेन्स प्रतिमा
AO आणि PI डाई हे दोन्ही पेशींच्या सेल न्यूक्लियसमधील डाग DNA आहेत.म्हणून, प्लेटलेट्स, लाल रक्तपेशी किंवा सेल्युलर मोडतोड PBMCs एकाग्रता आणि व्यवहार्यता परिणामांवर परिणाम करू शकत नाहीत.काउंटस्टार FL (आकृती 1) द्वारे व्युत्पन्न केलेल्या प्रतिमांच्या आधारे जिवंत पेशी, मृत पेशी आणि मोडतोड सहजपणे ओळखले जाऊ शकतात.
आकृती 2. PBMC च्या उजळ फील्ड आणि फ्लोरोसेन्स प्रतिमा
2. PBMC ची एकाग्रता आणि व्यवहार्यता
PBMC नमुने PBS सह 2, 4, 8 आणि 16 वेळा पातळ केले गेले, त्यानंतर ते नमुने AO/PI डाई मिश्रणाने उबवले गेले आणि काउंटस्टार FL द्वारे त्यांचे विश्लेषण केले गेले.PBMC च्या एकाग्रता आणि व्यवहार्यतेचा परिणाम खालील आकृतीप्रमाणे दर्शविला आहे:
