Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) ကို သိပ်သည်းဆ gradient centrifugation ဖြင့် သွေးတစ်ခုလုံးမှ ခွဲထုတ်ရန် မကြာခဏ လုပ်ဆောင်ပါသည်။ထိုဆဲလ်များတွင် lymphocytes (T cells, B cells, NK cells) နှင့် monocytes များ ပါ၀င်ပြီး ခုခံအား ဆိုင်ရာ၊ ဆဲလ် ကုထုံး၊ ကူးစက်ရောဂါ နှင့် ကာကွယ်ဆေး ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်ရေး နယ်ပယ်တွင် အသုံးများသည်။PBMC ၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းနှင့် အာရုံစူးစိုက်မှုကို စောင့်ကြည့်ခြင်းနှင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းသည် လက်တွေ့ဓာတ်ခွဲခန်းများ၊ အခြေခံဆေးသိပ္ပံသုတေသနနှင့် ခုခံအားဆဲလ်များ ထုတ်လုပ်မှုအတွက် အရေးကြီးပါသည်။
ပုံ ၁။ Density gradient centrifugation ဖြင့် လတ်ဆတ်သောသွေးမှ သီးခြား PBMC
AOPI Dual-fluoresces counting သည် ဆဲလ်များ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို ဖော်ထုတ်ရန်အတွက် အသုံးပြုသည့် စစ်ဆေးမှုအမျိုးအစားဖြစ်သည်။ဖြေရှင်းချက်မှာ acridine လိမ္မော်ရောင် (အစိမ်းရောင်-မီးချောင်း နျူကလိစ်အက်ဆစ် အစွန်းအထင်း) နှင့် ပရောပဒီယမ် အိုင်အိုဒိုက် (အနီရောင်-ဖြာထွက် နျူကလိစ်အက်ဆစ် အစွန်းအထင်း) တို့ ပေါင်းစပ်ထားသည်။Propidium iodide (PI) သည် ပျက်စီးနေသော အမြှေးပါးများဖြင့် ဆဲလ်များသာ ဝင်ရောက်သည့် အမြှေးပါး ဆိုးဆေးဖြစ်ပြီး acridine လိမ္မော်ရောင်သည် လူဦးရေအတွင်းရှိ ဆဲလ်အားလုံးကို စိမ့်ဝင်နိုင်သော်လည်း၊ဆိုးဆေးနှစ်မျိုးလုံးသည် နူကလိယတွင်ရှိနေသောအခါ၊ ပပဒီယမ်အိုင်အိုဒိုက်သည် fluorescence resonance energy transfer (FRET) ဖြင့် acridine လိမ္မော်ရောင်ဖျော့ဖျော့ကို လျော့နည်းစေသည်။ရလဒ်အနေဖြင့်၊ နဂိုအမြှေးပါးများပါရှိသော နျူကလီးယပ်ဆဲလ်များသည် ချောင်းစိမ်းရောင်စွန်းထင်းပြီး အသက်ရှင်နေသကဲ့သို့ ရေတွက်ခံရသော်လည်း ပျက်စီးနေသောအမြှေးပါးများပါသည့် ဆဲလ်များသည် မီးချောင်းအနီရောင်သာစွန်းထင်းနေပြီး Countstar® FL စနစ်ကို အသုံးပြုသည့်အခါ သေဆုံးသည်ဟု မှတ်ယူကြသည်။သွေးနီဥများ၊ သွေးဥများ နှင့် အပျက်အစီးများကဲ့သို့ နျူကလိယမပါဝင်သည့် ပစ္စည်းများသည် မီးချောင်းမပြဘဲ Countstar® FL ဆော့ဖ်ဝဲလ်မှ လျစ်လျူရှုထားသည်။
စမ်းသပ်မှုလုပ်ထုံးလုပ်နည်း-
1. PBMC နမူနာကို PBS ဖြင့် မတူညီသော ပြင်းအား 5 မျိုးအဖြစ် ရောချပါ။
2. 12µl AO/PI ဖြေရှင်းချက်ကို 12µl နမူနာထဲသို့ ထည့်ပါ၊ ပိုက်ဆက်နှင့် ညင်သာစွာ ရောစပ်ပါ။
3. 20µl အရောအနှောကို အခန်းလျှောထဲသို့ ဆွဲပါ။
4. ဆဲလ်များကို အခန်းထဲတွင် ၁ မိနစ်ခန့် အခြေချခွင့်ပြုပါ။
5.ဆလိုက်ကို Countstar FL တူရိယာထဲသို့ ပိုးသတ်ပါ။
6. "AO/PI Viability" assay ကို ရွေးပါ၊ ထို့နောက် Countstar FL မှ စမ်းသပ်ပါ။
သတိပြုရန်- AO နှင့် PI သည် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ကင်ဆာရောဂါတစ်မျိုးဖြစ်သည်။အော်ပရေတာသည် အရေပြားနှင့် မျက်လုံးများနှင့် တိုက်ရိုက်မထိတွေ့စေရန် တစ်ကိုယ်ရေ အကာအကွယ်ပစ္စည်း (PPE) ဝတ်ဆင်ရန် အကြံပြုထားသည်။
ရလဒ်:
1.PBMC ၏တောက်ပသောအကွက်နှင့် မီးရောင်အလင်းတန်းပုံများ
AO နှင့် PI ဆိုးဆေးသည် ဆဲလ်များ၏ ဆဲလ်နူကလိယရှိ DNA တွင် အစွန်းအထင်းများဖြစ်သည်။ထို့ကြောင့်၊ Platelets၊ သွေးနီဥများ သို့မဟုတ် ဆဲလ်အပျက်အစီးများသည် PBMCs အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် ရှင်သန်နိုင်စွမ်းရလဒ်အပေါ် သက်ရောက်မှုမရှိနိုင်ပါ။သက်ရှိဆဲလ်များ၊ ဆဲလ်သေများနှင့် အပျက်အစီးများကို Countstar FL (ပုံ 1) မှ ထုတ်လုပ်သည့် ပုံများပေါ်တွင် အခြေခံ၍ အလွယ်တကူ ခွဲခြားနိုင်ပါသည်။
ပုံ 2 .PBMC ၏တောက်ပသောအကွက်နှင့် မီးရောင်စုံပုံများ
2. PBMC ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် ရှင်သန်နိုင်စွမ်း
PBMC နမူနာများကို 2၊ 4၊ 8 နှင့် 16 ကြိမ်တွင် PBS ဖြင့် ရောစပ်ထားပြီး၊ ထို့နောက် အဆိုပါနမူနာများကို AO/PI ဆိုးဆေးအရောအနှောဖြင့် ပေါက်ဖွားပြီး Countstar FL မှ အသီးသီးခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပါသည်။PBMC ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် ရှင်သန်နိုင်မှုရလဒ်ကို အောက်ပါပုံအတိုင်း ပြသထားသည်။
