परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाहरू (PBMCs) प्रायः घनत्व ग्रेडियन्ट सेन्ट्रीफ्यूगेशन द्वारा सम्पूर्ण रगतबाट अलग गर्न प्रशोधन गरिन्छ।ती कोशिकाहरूमा लिम्फोसाइटहरू (टी कोशिकाहरू, बी कोशिकाहरू, एनके कोशिकाहरू) र मोनोसाइटहरू हुन्छन्, जुन सामान्यतया इम्युनोलोजी, सेल थेरापी, संक्रामक रोग र खोप विकासको क्षेत्रमा प्रयोग गरिन्छ।PBMC को व्यवहार्यता र एकाग्रता निगरानी र विश्लेषण क्लिनिकल प्रयोगशालाहरू, आधारभूत चिकित्सा विज्ञान अनुसन्धान र प्रतिरक्षा कोशिका उत्पादनको लागि महत्त्वपूर्ण छ।
चित्र 1. घनत्व ग्रेडियन्ट सेन्ट्रीफ्युगेशनको साथ ताजा रगतबाट अलग गरिएको PBMC
AOPI डुअल-फ्लोरेसेस गणना सेल एकाग्रता र व्यवहार्यता पत्ता लगाउन प्रयोग गरिने परख प्रकार हो।समाधान भनेको एक्रिडाइन सुन्तला (हरियो फ्लोरोसेन्ट न्यूक्लिक एसिड दाग) र प्रोपिडियम आयोडाइड (रातो-फ्लोरोसेन्ट न्यूक्लिक एसिड दाग) को संयोजन हो।प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) एक झिल्ली बहिष्करण डाई हो जुन केवल सम्झौता झिल्ली भएका कक्षहरूमा प्रवेश गर्दछ, जबकि एक्रिडाइन सुन्तला जनसंख्यामा सबै कोशिकाहरू प्रवेश गर्न सक्षम हुन्छ।जब दुबै रंगहरू न्यूक्लियसमा उपस्थित हुन्छन्, प्रोपिडियम आयोडाइडले फ्लोरोसेन्स रेजोनेन्स एनर्जी ट्रान्सफर (FRET) द्वारा एक्रिडाइन सुन्तला प्रतिदीप्तिमा कमी निम्त्याउँछ।नतिजाको रूपमा, अक्षुण्ण झिल्ली भएका न्यूक्लिएटेड कोशिकाहरू फ्लोरोसेन्ट हरियो दाग हुन्छन् र प्रत्यक्ष रूपमा गनिन्छन्, जबकि सम्झौता गरिएका झिल्लीहरू भएका न्यूक्लिएटेड कोशिकाहरू फ्लोरोसेन्ट रातो मात्र दाग हुन्छन् र Countstar® FL प्रणाली प्रयोग गर्दा मृतका रूपमा गणना गरिन्छ।रातो रक्त कोशिकाहरू, प्लेटलेटहरू र मलबे जस्ता गैर-न्यूक्लिएटेड सामग्रीहरू फ्लोरोस गर्दैनन् र Countstar® FL सफ्टवेयरद्वारा बेवास्ता गरिन्छ।
प्रयोगात्मक प्रक्रिया:
1. PBMC नमूनालाई PBS को साथ 5 विभिन्न सांद्रतामा पातलो गर्नुहोस्;
2. 12µl नमूनामा 12µl AO/PI समाधान थप्नुहोस्, बिस्तारै पिपेटसँग मिसाइएको;
3. च्याम्बर स्लाइडमा 20µl मिश्रण कोर्नुहोस्;
4. कक्षहरूलाई लगभग 1 मिनेटको लागि च्याम्बरमा बस्न अनुमति दिनुहोस्;
5. काउन्टस्टार FL उपकरणमा स्लाइडलाई कीट लगाउनुहोस्;
6. "AO/PI व्यवहार्यता" परख छान्नुहोस्, त्यसपछि काउन्टस्टार FL द्वारा परीक्षण गर्नुहोस्।
सावधानी: AO र PI एक सम्भावित कार्सिनोजेन हो।छाला र आँखाको प्रत्यक्ष सम्पर्कबाट बच्न अपरेटरलाई व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (पीपीई) लगाउन सिफारिस गरिन्छ।
नतिजा:
1. PBMC को उज्यालो क्षेत्र र फ्लोरोसेन्स छविहरू
AO र PI डाई दुबै कोशिकाको कोशिकाको केन्द्रकमा दाग DNA हुन्।त्यसकारण, प्लेटलेटहरू, रातो रक्त कोशिकाहरू, वा सेलुलर मलबेले PBMCs एकाग्रता र व्यवहार्यता परिणामलाई असर गर्न असमर्थ छन्।जीवित कोशिकाहरू, मृत कोशिकाहरू र भग्नावशेषहरू काउन्टस्टार FL (चित्र 1) द्वारा उत्पन्न छविहरूको आधारमा सजिलैसँग छुट्याउन सकिन्छ।
चित्र 2. PBMC को उज्यालो क्षेत्र र फ्लोरोसेन्स छविहरू
2. PBMC को एकाग्रता र व्यवहार्यता
PBMC नमूनाहरू 2, 4, 8 र 16 पटक PBS सँग पातलो गरिएको थियो, त्यसपछि ती नमूनाहरू AO/PI डाई मिश्रणको साथ इन्क्युबेटेड र काउन्टस्टार FL द्वारा विश्लेषण गरिएको थियो।PBMC को एकाग्रता र व्यवहार्यताको नतिजा तलको चित्रमा देखाइएको छ:
