Mononucleaire cellen van perifeer bloed (PBMC's) worden vaak verwerkt om van volbloed te scheiden door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie.Die cellen bestaan uit lymfocyten (T-cellen, B-cellen, NK-cellen) en monocyten, die vaak worden gebruikt op het gebied van immunologie, celtherapie, infectieziekten en vaccinontwikkeling.Het monitoren en analyseren van de levensvatbaarheid en concentratie van PBMC is cruciaal voor de klinische laboratoria, medisch basisonderzoek en de productie van immuuncellen.
Fig 1. Geïsoleerde PBMC uit vers bloed met centrifugering met dichtheidsgradiënt
AOPI Dual-fluorescen counting is het testtype dat wordt gebruikt voor het detecteren van celconcentratie en levensvatbaarheid.De oplossing is een combinatie van acridine-oranje (de groen-fluorescerende nucleïnezuurkleuring) en propidiumjodide (de rood-fluorescerende nucleïnezuurkleuring).Propidiumjodide (PI) is een membraanuitsluitingskleurstof die alleen cellen binnendringt met aangetaste membranen, terwijl acridine-sinaasappel alle cellen in een populatie kan binnendringen.Wanneer beide kleurstoffen in de kern aanwezig zijn, veroorzaakt propidiumjodide een vermindering van de acridine-oranje fluorescentie door fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET).Als resultaat kleuren kernhoudende cellen met intacte membranen fluorescerend groen en worden ze als levend geteld, terwijl kernhoudende cellen met aangetaste membranen alleen fluorescerend rood kleuren en als dood worden geteld bij gebruik van het Countstar® FL-systeem.Materialen zonder kern, zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en afval, fluoresceren niet en worden door de Countstar® FL-software genegeerd.
Experimentele procedure:
1.Verdun het PBMC-monster in 5 verschillende concentraties met PBS;
2.Voeg 12 µl AO/PI-oplossing toe aan het 12 µl-monster, voorzichtig gemengd met een pipet;
3. Trek 20 µl mengsel in het kamerglaasje;
4.Laat de cellen ongeveer 1 minuut in de kamer bezinken;
5.Insect de dia in Countstar FL-instrument;
6.Kies de “AO/PI-levensvatbaarheid”-assay en test vervolgens met Countstar FL.
Let op: AO en PI zijn mogelijk kankerverwekkend.Het wordt aanbevolen dat de bediener persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) draagt om direct contact met huid en ogen te vermijden.
Resultaat:
1. Heldere veld- en fluorescentiebeelden van de PBMC
De AO- en PI-kleurstof zijn beide DNA-vlekken in de celkern van cellen.Daarom kunnen bloedplaatjes, rode bloedcellen of celresten de PBMC-concentratie en het resultaat van de levensvatbaarheid niet beïnvloeden.Levende cellen, dode cellen en puin kunnen gemakkelijk worden onderscheiden op basis van de afbeeldingen die zijn gegenereerd door Countstar FL (Figuur 1).
Figuur 2: Helderveld- en fluorescentiebeelden van de PBMC
2. Concentratie en levensvatbaarheid van PBMC
De PBMC-monsters werden 2, 4, 8 en 16 keer verdund met PBS, vervolgens werden die monsters geïncubeerd met een AO/PI-kleurstofmengsel en respectievelijk geanalyseerd door Countstar FL.Het resultaat van concentratie en levensvatbaarheid van PBMC wordt getoond zoals hieronder figuur:
