Het analyseren van de leukocyten in volbloed is een routinetest in een klinisch laboratorium of bloedbank.De concentratie en levensvatbaarheid van de leukocyten zijn de vitale index als kwaliteitscontrole van bloedopslag.Afgezien van leukocyten bevat volbloed een groot aantal bloedplaatjes, rode bloedcellen of celresten, waardoor het onmogelijk is om volbloed direct onder de microscoop of helderveldcelteller te analyseren.Conventionele methoden om witte bloedcellen te tellen, omvatten het RBC-lysisproces, wat tijdrovend is.
AOPI Dual-fluorescen counting is het testtype dat wordt gebruikt voor het detecteren van celconcentratie en levensvatbaarheid.De oplossing is een combinatie van acridine-oranje (de groen-fluorescerende nucleïnezuurkleuring) en propidiumjodide (de rood-fluorescerende nucleïnezuurkleuring).Propidiumjodide (PI) is een membraanuitsluitingskleurstof die alleen cellen binnendringt met aangetaste membranen, terwijl acridine-sinaasappel alle cellen in een populatie kan binnendringen.Wanneer beide kleurstoffen in de kern aanwezig zijn, veroorzaakt propidiumjodide een vermindering van de acridine-oranje fluorescentie door fluorescentie-resonantie-energieoverdracht (FRET).Als gevolg hiervan kleuren genucleëerde cellen met intacte membranen fluorescerend groen en worden ze als levend geteld, terwijl genucleëerde cellen met aangetaste membranen alleen fluorescerend rood kleuren en als dood worden geteld bij gebruik van het Countstar® Rigel-systeem.
Countstar Rigel is een ideale oplossing voor veel complexe celpopulatiekarakteriseringsassays, waarmee snel witte bloedcellen in volbloed kunnen worden geanalyseerd.
Experimentele procedure:
1.Neem 20 µl bloedmonster en verdun het monster in 180 µl PBS.
2.Voeg 12 µl AO/PI-oplossing toe aan het 12 µl-monster, voorzichtig gemengd met een pipet;
3. Trek 20 µl mengsel in het kamerglaasje;
4.Laat de cellen ongeveer 1 minuut in de kamer bezinken;
5.Insect de dia in Countstar FL-instrument;
6.Kies de "AO/PI-levensvatbaarheid"-assay en voer vervolgens de monster-ID voor dit monster in.
7.Selecteer Verdunningsverhouding, Celtype en klik op 'Uitvoeren' om de test te starten.
Let op: AO en PI zijn mogelijk kankerverwekkend.Het wordt aanbevolen dat de bediener persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) draagt om direct contact met huid en ogen te vermijden.
Resultaat:
1. Helderveldbeeld van volbloed
In het helderveldbeeld van het volbloed zijn WBC's niet zichtbaar tussen de rode bloedcel.(Figuur 1)
Figuur 1 Helderveldbeeld van volbloed.
2. Fluorescentiebeeld van volbloed
De AO- en PI-kleurstof zijn beide DNA-vlekken in de celkern van cellen.Daarom kunnen bloedplaatjes, rode bloedcellen of celresten de leukocytenconcentratie en het resultaat van de levensvatbaarheid niet beïnvloeden.Levende leukocyten (groen) en dode leukocyten (rood) worden gemakkelijk gevisualiseerd in de fluorescentiebeelden.(Figuur 2)
Figuur 2 Fluorescentiebeelden van volbloed.(EEN).Afbeelding van AO-kanaal;(B) Afbeelding van PI-kanaal;(C) Voeg afbeeldingen van AO en PI Channel samen.
3. Concentratie en levensvatbaarheid van leukocyten
De Countstar FL-software telt automatisch cellen van drie kamersecties en berekent de gemiddelde waarde van het totale aantal WBC-cellen (1202), concentratie (1,83 x 106 cellen/ml) en % levensvatbaarheid (82,04%).De volbloedbeelden en -gegevens kunnen eenvoudig worden geëxporteerd als PDF, Afbeelding of Excel voor aanvullende analyse of gegevensarchivering.
Afbeelding 3 Screenshot van Countstar Rigel Software
