Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) behandles ofte for å skilles fra fullblod ved sentrifugering med tetthetsgradient.Disse cellene består av lymfocytter (T-celler, B-celler, NK-celler) og monocytter, vanligvis brukt innen immunologi, celleterapi, infeksjonssykdommer og vaksineutvikling.Overvåking og analyse av levedyktighet og konsentrasjon av PBMC er avgjørende for de kliniske laboratoriene, grunnleggende medisinsk vitenskapelig forskning og immuncelleproduksjon.
Fig. 1. Isolert PBMC fra ferskt blod med tetthetsgradientsentrifugering
AOPI Dual-fluoresces-telling er analysetypen som brukes for å oppdage cellekonsentrasjon og levedyktighet.Løsningen er en kombinasjon av akridinoransje (den grønnfluorescerende nukleinsyreflekken) og propidiumjodid (den rødfluorescerende nukleinsyreflekken).Propidiumjodid (PI) er et membraneksklusjonsfargestoff som bare kommer inn i celler med kompromitterte membraner, mens akridinoransje er i stand til å penetrere alle celler i en populasjon.Når begge fargestoffene er tilstede i kjernen, forårsaker propidiumjodid en reduksjon i akridinoransjefluorescens ved fluorescensresonansenergioverføring (FRET).Som et resultat av dette farges kjerneholdige celler med intakte membraner fluorescerende grønt og regnes som levende, mens kjerneholdige celler med kompromitterte membraner bare farges fluorescerende rødt og regnes som døde ved bruk av Countstar® FL-systemet.Ikke-kjerneholdig materiale som røde blodceller, blodplater og rusk fluorescerer ikke og ignoreres av Countstar® FL-programvaren.
Eksperimentell prosedyre:
1. Fortynn PBMC-prøven i 5 forskjellige konsentrasjoner med PBS;
2. Tilsett 12 µl AO/PI-løsning i 12 µl prøve, forsiktig blandet med pipette;
3. Trekk 20 µl blanding inn i kammerglasset;
4. La cellene sette seg i kammeret i ca. 1 minutt;
5. Insekter lysbildet i Countstar FL-instrumentet;
6.Velg "AO/PI Viability"-analysen, og test deretter av Countstar FL.
Forsiktig: AO og PI er potensielt kreftfremkallende.Det anbefales at operatøren bruker personlig verneutstyr (PPE) for å unngå direkte kontakt med hud og øyne.
Resultat:
1. Lysfelt og fluorescensbilder av PBMC
AO- og PI-fargestoffet er begge flekker DNA i cellekjernen til celler.Derfor kan ikke blodplater, røde blodlegemer eller celleavfall påvirke PBMCs konsentrasjon og levedyktighetsresultat.Levende celler, døde celler og rusk kan lett skilles ut basert på bildene generert av Countstar FL (Figur 1).
Figur 2．Bright Field and Fluorescence-bilder av PBMC
2. Konsentrasjon og levedyktighet av PBMC
PBMC-prøvene ble fortynnet i 2, 4, 8 og 16 ganger med PBS, deretter ble disse prøvene inkubert med en AO/PI-fargeblanding og analysert av henholdsvis Countstar FL.Resultatet av konsentrasjon og levedyktighet av PBMC er vist som figuren nedenfor:
