Abstrakcyjny: Mezenchymalne komórki macierzyste to podzbiór pluripotencjalnych komórek macierzystych, które można wyizolować z mezodermy.Dzięki ich samoreplikacji i wielokierunkowej charakterystyce różnicowania mają duży potencjał dla różnych terapii w medycynie.Mezenchymalne komórki macierzyste mają unikalny fenotyp immunologiczny i zdolność regulacji immunologicznej.Dlatego mezenchymalne komórki macierzyste są już szeroko stosowane w przeszczepianiu komórek macierzystych, inżynierii tkankowej i przeszczepianiu narządów.Poza tymi zastosowaniami są one wykorzystywane jako idealne narzędzie w inżynierii tkankowej jako komórki rozsiewające w serii podstawowych i klinicznych eksperymentów badawczych.Do chwili obecnej nie ma powszechnie akceptowanej metody i standardu kontroli jakości mezenchymalnych komórek macierzystych.Countstar Rigel może monitorować stężenie, żywotność i cechy fenotypowe (i ich zmiany) podczas produkcji i różnicowania tych komórek macierzystych.Countstar Rigel ma również tę zaletę, że uzyskuje dodatkowe informacje morfologiczne, dostarczane przez stałe rejestrowanie obrazu w jasnym polu i oparte na fluorescencji podczas całego procesu monitorowania jakości komórek.Countstar Rigel oferuje szybką, wyrafinowaną i niezawodną metodę kontroli jakości komórek macierzystych.
Materiały i metody:
Pochodzące z tkanki tłuszczowej mezenchymalne komórki macierzyste (AdMSC) zostały podarowane przez profesora Nianmin Qi, roztwór barwiący AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Przeciwciało: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (firma BD).
AdMSC hodowano w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 ℃, 5% CO2.Trawić trypsyną przed użyciem.
Procedurę barwienia markera CD postępowano zgodnie z instrukcją dotyczącą przeciwciała.
Wykrywanie markerów CD za pomocą Countstar Rigel:
1. Stworzono procedurę aplikacji koloru sygnału poprzez ustawienie kanału PE na obraz fluorescencji PE.
2. Z każdej komory schwytano 3 pola.
3. Po zakończeniu obrazowania i wstępnej analizy, ustawienie progu (bramka logarytmiczna) dla transfekcji pozytywnej i negatywnej zostało ustawione przez oprogramowanie FCS.
Kontrola jakości komórek macierzystych
Poniższy rysunek (Rysunek 1) przedstawia procedurę terapia komórkami macierzystymi .
Rysunek 1: Procedura terapii komórkami macierzystymi
Wyniki:
Określanie stężenia, żywotności, średnicy i agregacji AdMSC.
Żywotność AdMSCs określono za pomocą AO/PI. Dwukolorową procedurę aplikacji utworzono przez ustawienie kanału zielonego i kanału czerwonego do obrazowania fluorescencji AO i PI oraz jasnego pola.Przykładowe obrazy pokazano na rysunku 2.
Rysunek 2. Obrazy AdMSC przed transportem i po nim.A. Przed transportem;pokazany jest reprezentatywny obraz.B. Po transporcie;pokazany jest reprezentatywny obraz.
Żywotność AdMSC uległa drastycznej zmianie po transporcie w porównaniu z okresem przed transportem.Żywotność przed transportem wynosiła 92%, ale po transporcie zmniejszyła się do 71%.Wynik przedstawiono na rysunku 3.
Rysunek 3. Wyniki rentowności AdMSC (przed transportem i po transporcie)
Średnicę i agregację określił również Countstar Rigel.Średnica AdMSC zmieniła się drastycznie po transporcie w porównaniu z przed transportem.Średnica przed transportem wynosiła 19 µm, ale po transporcie wzrosła do 21 µm.Agregacja przed transportem wynosiła 20%, ale po transporcie wzrosła do 25%.Na podstawie zdjęć zarejestrowanych przez Countstar Rigel fenotyp AdMSC uległ drastycznej zmianie po transporcie.Wyniki przedstawiono na rysunku 4.
Rysunek 4: Wyniki dotyczące średnicy i agregacji.Odp.: Reprezentatywne obrazy AdMSC, fenotyp AdMSC uległy drastycznej zmianie po transporcie.B: Agregacja przed transportem wynosiła 20%, ale po transporcie wzrosła do 25%.C: Średnica przed transportem wynosiła 19 µm, ale po transporcie wzrosła do 21 µm.
Określ immunofenotyp AdMSC za pomocą Countstar Rigel
Immunofenotyp AdMSCs określono za pomocą Countstar Rigel, AdMSCs inkubowano odpowiednio z różnymi przeciwciałami (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Opracowano procedurę aplikacji koloru sygnału poprzez ustawienie kanału zielonego do obrazowania fluorescencji PE oraz jasnego pola.Segmentację odniesienia obrazu jasnego pola zastosowano jako maskę do próbkowania sygnału fluorescencji PE.Przedstawiono wyniki CD105 (Figura 5).
Figura 5: Wyniki CD105 AdMSCs zostały określone przez Countstar Rigel.A: Analiza ilościowa dodatniego odsetka CD105 w różnych próbkach za pomocą oprogramowania FCS express 5 plus.B: Obrazy wysokiej jakości dostarczają dodatkowych informacji morfologicznych.C: Potwierdzone wyniki za pomocą miniaturek każdej pojedynczej komórki, narzędzia programowe FCS podzieliły komórki na różne grupy zgodnie z ich zróżnicowaną ekspresją białka.
Wyniki innych przeciwciał pokazano na ryc. 6
Rysunek 6: A: Reprezentatywny obraz ASC o typowej morfologii wrzecionowatej.Uchwycony przez mikroskop firmy OLYMPUS.Oryginalne powiększenie (10x).B: Adipogeniczne zróżnicowanie ASC jest dowodem na barwienie Ruthenium Red ukazujące obszary mineralizacji.Uchwycony przez mikroskop firmy OLYMPUS.Oryginalne powiększenie (10x).C: Charakterystyka ASC Countstar FL.
Streszczenie:
Countstar FL może monitorować stężenie, żywotność i cechy fenotypowe (i ich zmiany) podczas produkcji i różnicowania tych komórek macierzystych.FCS express zapewnia funkcję przeglądania każdej komórki sygnałowej, sprawdzania poprawności danych za pomocą obrazu.Użytkownik może również mieć pewność, że przeprowadzi kolejne eksperymenty w oparciu o wyniki Countstar Rigel.Countstar Rigel oferuje szybką, wyrafinowaną i niezawodną metodę kontroli jakości komórek macierzystych.
