Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) są często przetwarzane w celu oddzielenia od krwi pełnej przez wirowanie w gradiencie gęstości.Komórki te składają się z limfocytów (komórki T, komórki B, komórki NK) i monocytów, powszechnie stosowanych w immunologii, terapii komórkowej, chorobach zakaźnych i opracowywaniu szczepionek.Monitorowanie i analizowanie żywotności i stężenia PBMC ma kluczowe znaczenie dla laboratoriów klinicznych, badań podstawowych nauk medycznych i produkcji komórek odpornościowych.
Ryc. 1. Wyizolowane PBMC ze świeżej krwi za pomocą wirowania w gradiencie gęstości
Zliczanie AOPI Dual-fluoresces jest typem testu używanym do wykrywania stężenia i żywotności komórek.Roztwór jest połączeniem oranżu akrydyny (barwnik kwasu nukleinowego o zielono fluorescencyjnym zabarwieniu) i jodku propidyny (barwnik kwasu nukleinowego o czerwonej fluorescencji).Jodek propidyny (PI) jest barwnikiem wykluczającym błonę, który przenika tylko do komórek z uszkodzonymi błonami, podczas gdy oranż akrydyny jest w stanie przeniknąć do wszystkich komórek w populacji.Gdy oba barwniki są obecne w jądrze, jodek propidyny powoduje zmniejszenie fluorescencji oranżu akrydyny poprzez transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET).W rezultacie komórki jądrzaste z nienaruszonymi błonami barwią się na zielono fluorescencyjnie i są liczone jako żywe, podczas gdy komórki jądrzaste z uszkodzonymi błonami barwią tylko na czerwono fluorescencyjnie i są liczone jako martwe przy użyciu systemu Countstar® FL.Materiały niejądrzaste, takie jak czerwone krwinki, płytki krwi i szczątki, nie ulegają fluorescencji i są ignorowane przez oprogramowanie Countstar® FL.
Procedura eksperymentalna:
1. Rozcieńczyć próbkę PBMC do 5 różnych stężeń za pomocą PBS;
2.Dodaj 12µl roztworu AO/PI do 12µl próbki, delikatnie wymieszaj pipetą;
3. Wciągnąć 20 µl mieszaniny do szkiełka komory;
4. Pozwól komórkom osiąść w komorze przez około 1 minutę;
5. Włóż slajd do instrumentu Countstar FL;
6. Wybierz test „AO/PI Viability”, a następnie przetestuj za pomocą Countstar FL.
Uwaga: AO i PI są potencjalnymi czynnikami rakotwórczymi.Zaleca się, aby operator nosił osobiste wyposażenie ochronne (PPE), aby uniknąć bezpośredniego kontaktu ze skórą i oczami.
Wynik:
1. Jasne pole i obrazy fluorescencyjne PBMC
Barwniki AO i PI są barwnikami DNA w jądrze komórkowym komórek.Dlatego płytki krwi, czerwone krwinki lub szczątki komórkowe nie są w stanie wpływać na stężenie PBMC i wynik żywotności.Żywe komórki, martwe komórki i szczątki można łatwo odróżnić na podstawie obrazów generowanych przez Countstar FL (Rysunek 1).
Rysunek 2．Jasne pole i obrazy fluorescencyjne PBMC
2. Koncentracja i żywotność PBMC
Próbki PBMC rozcieńczono 2, 4, 8 i 16 razy PBS, następnie próbki te inkubowano z mieszaniną barwników AO/PI i analizowano odpowiednio za pomocą Countstar FL.Wynik koncentracji i żywotności PBMC pokazano na poniższym rysunku:
