Abstrato: As células-tronco mesenquimais são um subconjunto de células-tronco pluripotentes que podem ser isoladas do mesoderma.Com suas características de renovação de autorreplicação e diferenciação multidirecional, possuem alto potencial para diversas terapias na medicina.As células-tronco mesenquimais têm um fenótipo imunológico único e capacidade de regulação imunológica.Portanto, as células-tronco mesenquimais já são amplamente utilizadas em transplantes de células-tronco, engenharia de tecidos e transplante de órgãos.Além dessas aplicações, eles são usados como uma ferramenta ideal na engenharia de tecidos como células semeadoras em uma série de experimentos de pesquisa básica e clínica.Até o momento, não existe um método e padrão amplamente aceitos para o controle de qualidade de células-tronco mesenquimais.O Countstar Rigel pode monitorar a concentração, viabilidade e características do fenótipo (e suas alterações) durante a produção e diferenciação dessas células-tronco.O Countstar Rigel também tem a vantagem de obter informações morfológicas adicionais, fornecidas pelo campo claro permanente e gravações de imagens baseadas em fluorescência durante todo o processo de monitoramento da qualidade das células.O Countstar Rigel oferece um método rápido, sofisticado e confiável para o controle de qualidade de células-tronco.
Materiais e métodos:
Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) foram oferecidas pelo Professor Nianmin Qi, solução de coloração AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Anticorpo: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
As AdMSCs foram cultivadas em uma incubadora umidificada com 37 ℃ e 5% de CO2.Digerir com tripsina antes de usar.
O procedimento de coloração do marcador CD foi seguido como o manual do anticorpo.
Detecção de marcador de CD com Countstar Rigel:
1. Um procedimento de aplicação de cor de sinal foi criado definindo o canal PE para fluorescência de imagem PE.
2. 3 campos foram capturados de cada câmara.
3. Após a conclusão da imagem e da análise inicial, a configuração do limiar (log gate) para transfecção positiva e negativa foi definida pelo software FCS.
Controle de qualidade de células-tronco
A Figura a seguir (Figura 1) mostra o procedimento de terapia com células-tronco .
Figura 1: O procedimento para terapia com células-tronco
Resultados:
Determinar a concentração, viabilidade, diâmetro e agregação de AdMSCs.
A viabilidade de AdMSCs foi determinada por AO/PI. Um procedimento de aplicação de duas cores foi criado definindo canal verde e canal vermelho para fluorescência de imagem AO e PI, além de um campo claro.Imagens de exemplo foram mostradas na Figura 2.
Figura 2. Imagens antes do transporte e após o transporte das AdMSCs.A. Antes do transporte;uma imagem representativa é mostrada.B. Após o transporte;uma imagem representativa é mostrada.
A viabilidade de AdMSCs foi alterada drasticamente após o transporte quando comparada com antes do transporte.A viabilidade antes do transporte era de 92%, mas reduziu para 71% após o transporte.O resultado foi mostrado na Figura 3.
Figura 3. Os resultados de viabilidade de AdMSCs (Antes do transporte e após o transporte)
O diâmetro e a agregação também foram determinados por Countstar Rigel.O diâmetro das AdMSCs foi alterado drasticamente após o transporte quando comparado com antes do transporte.O diâmetro antes do transporte era de 19µm, mas aumentou para 21µm após o transporte.A agregação de antes do transporte foi de 20%, mas aumentou para 25% após o transporte.A partir das imagens capturadas pelo Countstar Rigel, o fenótipo das AdMSCs foi alterado drasticamente após o transporte.Os resultados foram mostrados na Figura 4.
Figura 4: Os resultados de diâmetro e agregação.R: As imagens representativas das AdMSCs, o fenótipo das AdMSCs foram alterados drasticamente após o transporte.B: A agregação antes do transporte era de 20%, mas aumentou para 25% após o transporte.C: O diâmetro antes do transporte era de 19µm, mas aumentou para 21µm após o transporte.
Determinar o imunofenótipo de AdMSCs por Countstar Rigel
O imunofenótipo das AdMSCs foi determinado por Countstar Rigel, as AdMSCs foram incubadas com diferentes anticorpos respectivamente (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Um procedimento de aplicação de cor de sinal foi criado definindo um canal verde para fluorescência de imagem PE, além de um campo claro.A segmentação de referência de imagem de campo claro foi aplicada como uma máscara para amostrar o sinal de fluorescência de PE.Os resultados de CD105 foram mostrados (Figura 5).
Figura 5: Os resultados de CD105 de AdMSCs foram determinados por Countstar Rigel.A: Análise quantitativa da porcentagem positiva de CD105 em diferentes amostras pelo software FCS express 5 plus.B: Imagens de alta qualidade fornecem informações morfológicas adicionais.C: Resultados validados por miniaturas de cada célula, as ferramentas do software FCS dividiram as células em diferentes grupos de acordo com sua expressão proteica variável.
Outros resultados de anticorpos foram mostrados na Fig 6
Figura 6: A: Uma imagem representativa de ASCs com morfologia fusiforme típica.Capturado pelo microscópio OLYMPUS.Ampliação original, (10x).B: A diferenciação adipogênica das ASCs é evidenciada pela coloração com Ruthenium Red mostrando áreas de mineralização.Capturado pelo microscópio OLYMPUS.Ampliação original (10x).C: Caracterização Countstar FL de ASCs.
Resumo:
O Countstar FL pode monitorar a concentração, viabilidade e características do fenótipo (e suas alterações) durante a produção e diferenciação dessas células-tronco.O FCS express fornece a função de revisar cada célula de sinal, validar os dados através da imagem.O usuário também pode ter confiança para realizar os próximos experimentos com base nos resultados do Countstar Rigel.O Countstar Rigel oferece um método rápido, sofisticado e confiável para o controle de qualidade de células-tronco.
