Abstract: Celulele stem mezenchimale sunt un subset de celule stem pluripotente care pot fi izolate din mezoderm.Cu reînnoirea lor de auto-replicare și caracteristicile de diferențiere în mai multe direcții, ei posedă un potențial ridicat pentru diferite terapii în medicină.Celulele stem mezenchimale au un fenotip imunitar unic și o capacitate de reglare imună.Prin urmare, celulele stem mezenchimale sunt deja utilizate pe scară largă în transplanturile de celule stem, ingineria țesuturilor și transplantul de organe.Și, dincolo de aceste aplicații, ele sunt folosite ca instrument ideal în ingineria țesuturilor ca celule de însămânțare într-o serie de experimente de cercetare de bază și clinice.Până în prezent, nu există o metodă și un standard acceptat pe scară largă pentru controlul calității celulelor stem mezenchimale.Countstar Rigel poate monitoriza concentrația, viabilitatea și caracteristicile fenotipului (și modificările acestora) în timpul producției și diferențierii acestor celule stem.Countstar Rigel are, de asemenea, avantajul de a obține informații morfologice suplimentare, furnizate de înregistrările permanente de imagini bazate pe câmp luminos și fluorescență pe parcursul întregului proces de monitorizare a calității celulelor.Countstar Rigel oferă o metodă rapidă, sofisticată și fiabilă pentru controlul calității celulelor stem.
Materiale și metode:
Celulele stem mezenchimale derivate din adipos (AdMSC) au fost dăruite de profesorul Nianmin Qi, soluție de colorare AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Anticorp: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (Compania BD).
AdMSC-urile au fost cultivate într-un incubator umidificat la 37℃, 5% CO2.Digerați cu tripsină înainte de utilizare.
Procedura de colorare a markerului CD a fost urmată ca manual de anticorpi.
Detectarea markerului CD cu Countstar Rigel:
1. A fost creată o procedură de aplicare a culorii semnalului prin setarea canalului PE la fluorescența PE imagine.
2. S-au capturat 3 câmpuri din fiecare cameră.
3. După ce imagistica și analiza inițială au fost finalizate, setarea pragului (poarta log) pentru transfecția pozitivă și negativă a fost stabilită de software-ul FCS.
Controlul calității celulelor stem
Următoarea figură (Figura 1) arată procedura de terapia cu celule stem .
Figura 1: Procedura pentru terapia cu celule stem
Rezultate:
Determinarea concentrației, viabilității, diametrului și agregarii AdMSC-urilor.
Viabilitatea AdMSC-urilor a fost determinată de AO/PI, o procedură de aplicare cu două culori a fost creată prin setarea canalului verde și canalului roșu la imaginea AO și fluorescența PI, plus un câmp luminos.Exemple de imagini au fost prezentate în Figura 2.
Figura 2. Imaginile înainte de transport și după transportul AdMSC-urilor.A. Înainte de transport;este prezentată o imagine reprezentativă.B. După transport;este prezentată o imagine reprezentativă.
Viabilitatea AdMSC-urilor a fost schimbată drastic după transport, în comparație cu înainte de transport.Viabilitatea înainte de transport a fost de 92%, dar s-a redus la 71% după transport.Rezultatul a fost prezentat în Figura 3.
Figura 3. Rezultatele viabilității AdMSC-urilor (înainte de transport și după transport)
Diametrul și agregarea au fost, de asemenea, determinate de Countstar Rigel.Diametrul AdMSC-urilor a fost modificat drastic după transport, în comparație cu înainte de transport.Diametrul înainte de transport a fost de 19 µm, dar a crescut la 21 µm după transport.Agregarea înainte de transport a fost de 20%, dar a crescut la 25% după transport.Din imaginile capturate de Countstar Rigel, fenotipul AdMSC-urilor a fost schimbat drastic după transport.Rezultatele au fost prezentate în Figura 4.
Figura 4: Rezultate diametrul și agregarea.R: Imaginile reprezentative ale AdMSC-urilor, fenotipul AdMSC-urilor au fost schimbate drastic după transport.B: Agregarea înainte de transport a fost de 20%, dar a crescut la 25% după transport.C: Diametrul înainte de transport a fost de 19 µm, dar a crescut la 21 µm după transport.
Determinați imunofenotipul AdMSC-urilor de către Countstar Rigel
Imunofenotipul AdMSC-urilor a fost determinat de Countstar Rigel, AdMSC-urile au fost incubate cu anticorpi diferiți, respectiv (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).O procedură de aplicare a culorii semnalului a fost creată prin setarea unui canal verde pentru imaginea fluorescenței PE, plus un câmp luminos.Segmentarea de referință a imaginii în câmp luminos a fost aplicată ca mască pentru a preleva semnalul de fluorescență PE.Rezultatele CD105 au fost prezentate (Figura 5).
Figura 5: Rezultatele CD105 ale AdMSC au fost determinate de Countstar Rigel.R: Analiza cantitativă a procentului pozitiv de CD105 din diferite probe prin software-ul FCS express 5 plus.B: Imaginile de înaltă calitate furnizează informații morfologice suplimentare.C: Rezultate validate prin miniaturi ale fiecărei celule, instrumentele software FCS au împărțit celulele în diferite grupuri în funcție de expresia lor variată a proteinei.
Rezultatele altor anticorpi au fost prezentate în Fig 6
Figura 6: A: O imagine reprezentativă a ASC-urilor cu morfologie tipică în formă de fus.Captură de microscopul OLYMPUS.Mărire originală, (10x).B: Diferențierea adipogenă a ASC-urilor este evidențiată prin colorarea cu roșu ruteniu care arată zone de mineralizare.Captură de microscopul OLYMPUS.Mărire originală (10x).C: Caracterizarea Countstar FL a ASC-urilor.
Rezumat:
Countstar FL poate monitoriza concentrația, viabilitatea și caracteristicile fenotipului (și modificările acestora) în timpul producției și diferențierii acestor celule stem.FCS express furnizează funcția de a revizui fiecare celulă de semnal, de a valida datele prin imagine.De asemenea, utilizatorul poate avea încredere să efectueze următoarele experimente pe baza rezultatelor Countstar Rigel.Countstar Rigel oferă o metodă rapidă, sofisticată și fiabilă pentru controlul calității celulelor stem.
