Celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) sunt adesea procesate pentru a se separa de sângele integral prin centrifugare cu gradient de densitate.Aceste celule sunt formate din limfocite (celule T, celule B, celule NK) și monocite, utilizate în mod obișnuit în domeniul imunologiei, terapiei celulare, bolilor infecțioase și dezvoltării vaccinurilor.Monitorizarea și analizarea viabilității și concentrației PBMC este crucială pentru laboratoarele clinice, cercetarea de bază în știința medicală și producția de celule imune.
Fig 1. PBMC izolate din sânge proaspăt cu centrifugare cu gradient de densitate
Numărarea cu fluorescență duală AOPI este tipul de analiză utilizat pentru detectarea concentrației și viabilității celulelor.Soluția este o combinație de acridină portocalie (colorația verde-fluorescentă a acidului nucleic) și iodură de propidiu (colorația roșie-fluorescentă a acidului nucleic).Iodura de propidiu (PI) este un colorant de excludere a membranei care intră doar în celulele cu membrane compromise, în timp ce portocaliul de acridină este capabil să pătrundă în toate celulele dintr-o populație.Când ambii coloranți sunt prezenți în nucleu, iodura de propidiu determină o reducere a fluorescenței portocalii de acridină prin transferul de energie de rezonanță a fluorescenței (FRET).Ca rezultat, celulele nucleate cu membrane intacte colorează verde fluorescent și sunt numărate ca fiind vii, în timp ce celulele nucleate cu membrane compromise colorează doar roșu fluorescent și sunt numărate ca moarte când se utilizează sistemul Countstar® FL.Materialele nenucleate, cum ar fi globulele roșii, trombocitele și resturile nu au fluorescență și sunt ignorate de software-ul Countstar® FL.
Procedura experimentala:
1. Diluați proba de PBMC în 5 concentrații diferite cu PBS;
2. Adăugați 12 µl de soluție AO/PI într-o probă de 12 µl, amestecată ușor cu pipeta;
3.Atrageți 20µl amestec în lama camerei;
4. Lăsați celulele să se așeze în cameră timp de aproximativ 1 minut;
5.Insectați diapozitivul în instrumentul Countstar FL;
6.Alegeți testul „Viabilitate AO/PI”, apoi testați cu Countstar FL.
Atenție: AO și PI sunt un potențial cancerigen.Se recomandă ca operatorul să poarte echipament individual de protecție (EIP) pentru a evita contactul direct cu pielea și ochii.
Rezultat:
1.Câmp luminos și imagini de fluorescență ale PBMC
Colorantul AO și PI sunt ambele colorante de ADN din nucleul celular al celulelor.Prin urmare, trombocitele, globulele roșii sau resturile celulare nu pot afecta concentrația și viabilitatea PBMC-urilor.Celulele vii, celulele moarte și resturile pot fi distinse cu ușurință pe baza imaginilor generate de Countstar FL (Figura 1).
Figura 2. Imagini cu câmp luminos și fluorescență ale PBMC
2.Concentrarea și viabilitatea PBMC
Probele PBMC au fost diluate de 2, 4, 8 și 16 ori cu PBS, apoi acele probe au fost incubate cu un amestec de coloranți AO/PI și, respectiv, analizate de Countstar FL.Rezultatul concentrării și viabilității PBMC este prezentat în figura de mai jos:
