Абстрактный: Мезенхимальные стволовые клетки представляют собой подмножество плюрипотентных стволовых клеток, которые можно выделить из мезодермы.Обладая характеристиками саморепликации и многонаправленной дифференцировки, они обладают высоким потенциалом для различных методов лечения в медицине.Мезенхимальные стволовые клетки обладают уникальным иммунным фенотипом и способностью к иммунной регуляции.Поэтому мезенхимальные стволовые клетки уже широко используются в трансплантации стволовых клеток, тканевой инженерии и трансплантации органов.И помимо этих приложений, они используются в качестве идеального инструмента в тканевой инженерии в качестве затравочных клеток в серии фундаментальных и клинических исследовательских экспериментов.До сих пор не существует общепринятого метода и стандарта контроля качества мезенхимальных стволовых клеток. может отслеживать концентрацию, жизнеспособность и характеристики фенотипа (и их изменения) во время производства и дифференцировки этих стволовых клеток.Преимущество также заключается в получении дополнительной морфологической информации, обеспечиваемой постоянным световым полем и записью изображений на основе флуоресценции в течение всего процесса мониторинга качества клеток. предлагает быстрый, сложный и надежный метод контроля качества стволовых клеток.
Материалы и методы:
Мезенхимальные стволовые клетки жирового происхождения (AdMSC) были подарены профессором Nianmin Qi, окрашивающим раствором AO/PI (Shanghai RuiYu, CF002).Антитела: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (компания BD).
AdMSC культивировали в увлажненном инкубаторе при 37 ℃, 5% CO2.Перед употреблением переварить трипсином.
Процедура окрашивания маркера CD выполнялась в соответствии с руководством по антителу.
Обнаружение маркера CD с помощью Countstar Rigel :
1. Процедура применения сигнального цвета была создана путем установки канала PE для изображения флуоресценции PE.
2. Из каждой камеры захватывали по 3 поля.
3. После завершения визуализации и начального анализа с помощью программного обеспечения FCS устанавливали пороговое значение (логарифмический порог) для положительной и отрицательной трансфекции.
Контроль качества стволовых клеток
На следующем рисунке (Рисунок 1) показана процедура терапия стволовыми клетками .
Рисунок 1: Процедура терапии стволовыми клетками
Полученные результаты:
Определение концентрации, жизнеспособности, диаметра и агрегации AdMSC.
Жизнеспособность AdMSC определяли с помощью AO/PI. Процедура двухцветного применения была создана путем установки зеленого канала и красного канала для изображения флуоресценции AO и PI, а также светлого поля.Примеры изображений показаны на рисунке 2.
Рисунок 2. Изображения AdMSC до и после транспортировки.А. Перед транспортировкой;показано репрезентативное изображение.Б. После транспортировки;показано репрезентативное изображение.
Жизнеспособность AdMSC резко изменилась после транспортировки по сравнению с до транспортировки.Жизнеспособность до транспортировки составляла 92%, но после транспортировки она снижалась до 71%.Результат показан на рисунке 3.
Рисунок 3. Результаты жизнеспособности AdMSC (до транспортировки и после транспортировки)
Диаметр и агрегацию также определяли с помощью .Диаметр AdMSC резко изменился после транспортировки по сравнению с до транспортировки.Диаметр до транспортировки составлял 19 мкм, но после транспортировки он увеличился до 21 мкм.Агрегация до транспортировки составляла 20%, но после транспортировки она возрастала до 25%.Судя по изображениям, полученным с помощью , фенотип AdMSC резко изменился после транспортировки.Результаты представлены на рисунке 4.
Рисунок 4: Диаметр и результаты агрегации.A: Репрезентативные изображения AdMSCs, фенотип AdMSCs резко изменились после транспортировки.B: Агрегация до транспортировки составляла 20%, но после транспортировки она увеличилась до 25%.C: Диаметр до транспортировки составлял 19 мкм, но после транспортировки он увеличился до 21 мкм.
Определить иммунофенотип AdMSCs с помощью Countstar Rigel
Иммунофенотип AdMSC определяли с помощью , AdMSC инкубировали с различными антителами соответственно (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Процедура применения сигнального цвета была создана путем установки зеленого канала для изображения флуоресценции PE плюс светлое поле.Эталонная сегментация изображения в светлом поле применялась в качестве маски для выборки флуоресцентного сигнала PE.Были показаны результаты CD105 (Фигура 5).
Рисунок 5: Результаты CD105 AdMSC были определены .A: Количественный анализ положительного процента CD105 в различных образцах с помощью программного обеспечения FCS Express 5 plus.B: Высококачественные изображения предоставляют дополнительную морфологическую информацию.C: Подтвержденные результаты миниатюрами каждой отдельной клетки, программные инструменты FCS разделили клетки на разные группы в соответствии с различной экспрессией их белка.
Результаты для других антител показаны на рис. 6.
Рисунок 6: A: репрезентативное изображение ASCs с типичной веретенообразной морфологией.Снято микроскопом OLYMPUS.Оригинальное увеличение, (10x).B: Адипогенная дифференциация ASC подтверждается окрашиванием рутениевым красным, показывающим области минерализации.Снято микроскопом OLYMPUS.Оригинальное увеличение (10x).C: Характеристика ASC FL.
Резюме:
Countstar FL может отслеживать концентрацию, жизнеспособность и характеристики фенотипа (и их изменения) во время производства и дифференцировки этих стволовых клеток.FCS Express предоставляет функцию просмотра каждой сигнальной ячейки, проверки данных с помощью изображения.Пользователь также может быть уверен в проведении следующих экспериментов на основе результатов . предлагает быстрый, сложный и надежный метод контроля качества стволовых клеток.
