Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) часто отделяют от цельной крови центрифугированием в градиенте плотности.Эти клетки состоят из лимфоцитов (Т-клетки, В-клетки, NK-клетки) и моноцитов, обычно используемых в области иммунологии, клеточной терапии, инфекционных заболеваний и разработки вакцин.Мониторинг и анализ жизнеспособности и концентрации РВМС имеет решающее значение для клинических лабораторий, фундаментальных медицинских исследований и производства иммунных клеток.
Рис. 1. Изолированные РВМС из свежей крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности.
Двойной флуоресцентный подсчет AOPI — это тип анализа, используемый для определения концентрации и жизнеспособности клеток.Решение представляет собой комбинацию акридинового оранжевого (зеленая флуоресцентная окраска нуклеиновой кислоты) и йодида пропидия (красная флуоресцентная окраска нуклеиновой кислоты).Йодид пропидия (PI) представляет собой краситель для исключения мембран, который проникает только в клетки с поврежденными мембранами, в то время как акридиновый оранжевый способен проникать во все клетки в популяции.Когда в ядре присутствуют оба красителя, йодид пропидия вызывает снижение флуоресценции акридинового оранжевого за счет резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).В результате ядросодержащие клетки с неповрежденными мембранами окрашиваются флуоресцентно-зеленым цветом и считаются живыми, тогда как ядросодержащие клетки с нарушенными мембранами окрашиваются только флуоресцентно-красным цветом и считаются мертвыми при использовании системы FL.Материалы без ядер, такие как эритроциты, тромбоциты и дебрис, не флуоресцируют и игнорируются программным обеспечением FL.
Экспериментальная процедура:
1. Разбавьте образец РВМС до 5 различных концентраций с помощью PBS;
2. Добавьте 12 мкл раствора AO/PI в 12 мкл образца, аккуратно перемешайте пипеткой;
3. Наберите 20 мкл смеси на предметное стекло;
4. Дайте клеткам осесть в камере примерно на 1 минуту;
5. Вставьте предметное стекло в Countstar FL;
6. Выберите анализ «Жизнеспособность AO/PI», затем выполните тест с помощью Countstar FL.
Предупреждение: АО и ПИ являются потенциальным канцерогеном.Оператору рекомендуется носить средства индивидуальной защиты (СИЗ) во избежание прямого контакта с кожей и глазами.
Результат:
1. Светлопольные и флуоресцентные изображения РВМС
Оба красителя АО и PI окрашивают ДНК в клеточном ядре клеток.Таким образом, тромбоциты, эритроциты или клеточный дебрис не могут повлиять на концентрацию РВМС и результат жизнеспособности.Живые клетки, мертвые клетки и мусор можно легко различить на основе изображений, созданных FL (рис. 1).
Рис. 2. Яркопольные и флуоресцентные изображения РВМС.
2. Концентрация и жизнеспособность РВМС
Образцы РВМС разбавляли в 2, 4, 8 и 16 раз PBS, затем эти образцы инкубировали со смесью красителей AO/PI и анализировали с помощью FL соответственно.Результат концентрации и жизнеспособности РВМС показан на рисунке ниже:
