Peripheral blood mononuclear Cells (PBMCs) اڪثر ڪري پوري رت کان الڳ ڪرڻ لاءِ پروسيس ڪيو ويندو آهي density gradient centrifugation ذريعي.اهي سيلز ليمفوسائيٽس (ٽي سيلز، بي سيلز، اين جي سيلز) ۽ مونوڪائٽس تي مشتمل آهن، عام طور تي مدافعتيات، سيل جي علاج، انفيڪشن جي بيماري ۽ ويڪسين جي ترقي ۾ استعمال ٿيندا آهن.PBMC جي قابليت ۽ ڪنسنٽريشن جي نگراني ۽ تجزيو ڪلينڪل ليبارٽريز، بنيادي طبي سائنس جي تحقيق ۽ مدافعتي سيل جي پيداوار لاءِ اهم آهي.
تصوير 1. ڊينسٽي گريڊيئنٽ سينٽرفيوگريشن سان تازو رت مان PBMC کي الڳ ڪيو ويو
AOPI Dual-fluoresces ڳڻپ جو قسم آهي جيڪو سيل ڪنسنٽريشن ۽ وابستگي کي ڳولڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي.حل هڪريڊين نارنگي (سبز فلورسنٽ نيوڪلڪ ايسڊ داغ) ۽ پروپيڊيم آئيوڊائڊ (ڳاڙهي فلورسنٽ نيوڪلڪ ايسڊ داغ) جو ميلاپ آهي.Propidium iodide (PI) ھڪڙو جھلي خارج ڪرڻ وارو رنگ آھي جيڪو صرف ٺھيل جھلين سان سيلن ۾ داخل ٿئي ٿو، جڏھن ته ايڪريڊين نارنگي آبادي ۾ سڀني سيلن کي گھڙڻ جي قابل آھي.جڏهن ٻئي رنگ نيوڪلئس ۾ موجود هوندا آهن، پروپيڊيم آئوڊائڊ فلورسنس گونج انرجي ٽرانسفر (FRET) ذريعي ايڪريڊين نارنجي فلورسنس ۾ گهٽتائي جو سبب بڻجندو آهي.نتيجي جي نتيجي ۾، نيوڪليٽ ٿيل سيلن سان گڏ فلورسنٽ سائي رنگ جو داغ لڳندو آهي ۽ زنده طور شمار ڪيو ويندو آهي، جڏهن ته ٺهڪندڙ جھلين سان نيوڪليٽ ٿيل سيل صرف فلورسنٽ ڳاڙهي داغ ڪن ٿا ۽ Countstar® FL سسٽم کي استعمال ڪرڻ وقت مئل طور شمار ڪيو وڃي ٿو.غير نيوڪيليٽ مواد جهڙوڪ ڳاڙهي رت جي سيلز، پليٽليٽس ۽ ملبوس فلورس نه ڪندا آهن ۽ Countstar® FL سافٽ ويئر پاران نظر انداز ڪيا ويا آهن.
تجرباتي طريقو:
1. PBMC نموني کي PBS سان 5 مختلف ڪنسنٽريشن ۾ گھٽايو؛
2. 12µl AO/PI حل 12µl نموني ۾ شامل ڪريو، آسانيءَ سان پائيپٽ سان ملايو؛
3. چيمبر سلائيڊ ۾ 20µl مرکب ٺاھيو؛
4. سيلز کي تقريبا 1 منٽ لاء چيمبر ۾ آباد ٿيڻ جي اجازت ڏيو؛
5. سلائيڊ کي ڳڻپيوڪر FL اوزار ۾ داخل ڪريو؛
6. چونڊيو "AO/PI Viability" جو امتحان، پوءِ ٽيسٽ ڪريو Countstar FL.
احتياط: AO ۽ PI هڪ امڪاني ڪارڪينجن آهي.اها سفارش ڪئي وئي آهي ته آپريٽر ذاتي حفاظتي سامان (پي پي اي) پائڻ لاءِ چمڙي ۽ اکين سان سڌو رابطو کان بچڻ لاءِ.
نتيجو:
1. PBMC جي روشني فيلڊ ۽ فلورسنس تصويرون
AO ۽ PI رنگ ٻئي داغ آهن DNA جي سيلن جي نيوڪليس ۾.تنهن ڪري، پليٽليٽ، ڳاڙهي رت جي سيلز، يا سيلولر ملبي PBMCs جي ڪنسنٽريشن ۽ قابل عمل نتيجن کي متاثر ڪرڻ جي قابل نه آهن.زنده خانا، مئل خانا ۽ ملبہ آسانيءَ سان سڃاڻي سگھجن ٿا تصويرن جي بنياد تي Countstar FL (Figure 1).
شڪل 2. PBMC جي روشن ميدان ۽ فلورسنس تصويرون
2. PBMC جي ڪنسنٽريشن ۽ قابل عمل
پي بي ايم سي جا نمونا 2، 4، 8 ۽ 16 ڀيرا پي بي بي سان ملائي ويا، پوءِ انهن نمونن کي AO/PI ڊائي مرکب سان لڳايو ويو ۽ ڳڻپيوڪر FL پاران ترتيب سان تجزيو ڪيو ويو.PBMC جي ڪنسنٽريشن ۽ قابليت جو نتيجو هيٺ ڏنل شڪل ۾ ڏيکاريو ويو آهي:
