Systém Countstar spája obrazový cytometer a počítadlo buniek do jedného stolného prístroja.Tento aplikovaný, kompaktný a automatizovaný systém zobrazovania buniek poskytuje komplexné riešenie pre výskum rakovinových buniek, vrátane počítania buniek, životaschopnosti (AO/PI, trypánová modrá), apoptózy (Annexin V-FITC/PI), buniek cyklu (PI) a transfekcie GFP/RFP.
Abstraktné
Rakovina je jednou z hlavných príčin úmrtí na celom svete a vývoj nových metód liečby rakoviny má veľký význam.Rakovinová bunka je základným výskumným objektom rakoviny, z rakovinovej bunky je potrebné vyhodnotiť rôzne informácie.Táto oblasť výskumu potrebuje rýchlu, spoľahlivú, jednoduchú a podrobnú analýzu buniek.Systém Countstar poskytuje jednoduchú platformu riešenia pre analýzu rakovinových buniek.
Štúdia apoptózy rakovinových buniek podľa Countstar Rigel
Testy apoptózy sa rutinne používajú v mnohých laboratóriách na rôzne účely od hodnotenia zdravia bunkových kultúr až po hodnotenie toxicity panelu zlúčenín.
Test apoptózy je typ používaný na stanovenie percenta apoptózy buniek metódou farbenia Annexin V-FITC/PI.Anexín V sa viaže na fosfatidylserín (PS) s bunkou včasnej apoptózy alebo bunkou nekrózy.PI vstupuje len do nekrotických/veľmi neskorých apoptotických buniek.(Postava 1)
A: Včasná apoptóza Annexin V (+), PI (-)
B: Neskorá apoptóza Annexin V (+), PI (+)
Obrázok 1: Zväčšené detaily obrázkov Countstar Rigel (5-násobné zväčšenie) 293 buniek, ošetrených Annexinom V FITC a PI
Analýza bunkového cyklu rakovinových buniek
Bunkový cyklus alebo cyklus bunkového delenia je séria dejov, ktoré prebiehajú v bunke a vedú k jej deleniu a duplikácii DNA (replikácii DNA), aby vznikli dve dcérske bunky.V bunkách s jadrom, ako v eukaryotoch, je bunkový cyklus tiež rozdelený do troch období: interfáza, mitotická (M) fáza a cytokinéza.Propidium jodid (PI) je jadrové farbivo, ktoré sa často používa na meranie bunkového cyklu.Pretože farbivo nemôže vstúpiť do živých buniek, bunky sa pred farbením fixujú etanolom.Všetky bunky sa potom zafarbia.Bunky pripravujúce sa na delenie budú obsahovať rastúce množstvo DNA a vykazujú proporcionálne zvýšenú fluorescenciu.Rozdiely v intenzite fluorescencie sa používajú na určenie percenta buniek v každej fáze bunkového cyklu.Countstar dokáže zachytiť obrázok a výsledky sa zobrazia v softvéri FCS Express.(Obrázok 2)
Obrázok 2: MCF-7 (A) a 293T (B) boli zafarbené pomocou súpravy na detekciu bunkového cyklu s PI, výsledky boli stanovené pomocou Countstar Rigel a analyzované pomocou FCS express.
Stanovenie životaschopnosti a GFP transfekcie v bunke
Počas bioprocesu sa GFP často používa na fúziu s rekombinantným proteínom ako indikátorom.Určite, že fluorescencia GFP môže odrážať expresiu cieľového proteínu.Countstar Rigel ponúka rýchly a jednoduchý test na testovanie transfekcie GFP, ako aj životaschopnosti.Bunky sa zafarbili propidium jodidom (PI) a Hoechst 33342, aby sa definovala populácia mŕtvych buniek a celková populácia buniek.Countstar Rigel ponúka rýchlu, kvantitatívnu metódu na vyhodnotenie účinnosti expresie GFP a zároveň životaschopnosti.(Obrázok 4)
Obrázok 4: Bunky sú lokalizované pomocou Hoechst 33342 (modrá) a percento buniek exprimujúcich GFP (zelené) sa dá ľahko určiť.Neživotaschopné bunky sú zafarbené propidium jodidom (PI; červená).
Životaschopnosť a počet buniek
Počítanie AO/PI s duálnou fluorescenciou je typ testu používaný na detekciu koncentrácie buniek, životaschopnosti.Rozdelil sa na počítanie bunkových línií a počítanie primárnych buniek podľa rôznych typov buniek.Roztok obsahuje kombináciu zeleno-fluorescenčného farbiva nukleovej kyseliny, akridínovej oranžovej, a červenofluorescenčného farbiva nukleovej kyseliny, propídium jodid.Propidium jodid je membránové vylučovacie farbivo, ktoré vstupuje len do buniek s poškodenými membránami, zatiaľ čo akridínová oranž preniká do všetkých buniek v populácii.Keď sú v jadre prítomné obe farbivá, propídiumjodid spôsobí zníženie fluorescencie akridínovej oranže prenosom fluorescenčnej rezonančnej energie (FRET).Výsledkom je, že bunky s jadrami s neporušenými membránami sa farbia fluorescenčne zelenou farbou a počítajú sa ako živé, zatiaľ čo bunky s jadrami s narušenými membránami sa farbia iba fluorescenčnou červenou farbou a pri použití systému Countstar Rigel sa počítajú ako mŕtve.Materiál bez jadier, ako sú červené krvinky, krvné doštičky a zvyšky, nefluoreskujú a softvér Countstar Rigel ich ignoruje.(Obrázok 5)
Obrázok 5: Countstar optimalizoval metódu dvojitého fluorescenčného farbenia na jednoduché a presné stanovenie koncentrácie a životaschopnosti PBMC.Vzorky zafarbené AO/PI možno analyzovať pomocou Counstar Rigel
