Abstrakt: Mezenchymálne kmeňové bunky sú podskupinou pluripotentných kmeňových buniek, ktoré možno izolovať z mezodermu.Vďaka svojej obnove sebareplikácie a viacsmernej diferenciácii majú vysoký potenciál pre rôzne terapie v medicíne.Mezenchymálne kmeňové bunky majú jedinečný imunitný fenotyp a schopnosť imunitnej regulácie.Mezenchymálne kmeňové bunky sa preto už široko používajú pri transplantáciách kmeňových buniek, tkanivovom inžinierstve a transplantácii orgánov.A okrem týchto aplikácií sa používajú ako ideálny nástroj v tkanivovom inžinierstve ako očkovacie bunky v sérii základných a klinických výskumných experimentov.Doteraz neexistuje široko akceptovaná metóda a štandard na kontrolu kvality mezenchymálnych kmeňových buniek.Countstar Rigel môže monitorovať koncentráciu, životaschopnosť a fenotypové charakteristiky (a ich zmeny) počas produkcie a diferenciácie týchto kmeňových buniek.Countstar Rigel má tiež výhodu v získavaní dodatočných morfologických informácií, poskytovaných permanentným jasným a fluorescenčným záznamom obrazu počas celého procesu monitorovania kvality buniek.Countstar Rigel ponúka rýchlu, sofistikovanú a spoľahlivú metódu kontroly kvality kmeňových buniek.
Materiály a metódy:
Mezenchymálne kmeňové bunky získané z tukového tkaniva (AdMSC) boli darované profesorom Nianminom Qi, AO/PI farbiacim roztokom (Shanghai RuiYu, CF002).Protilátky: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
AdMSC sa kultivovali vo zvlhčovanom inkubátore pri teplote 37 °C a 5 % CO2.Pred použitím trávte s trypsínom.
Postup farbenia CD markerov bol dodržaný ako manuál protilátky.
Detekcia CD markerov pomocou Countstar Rigel:
1. Procedúra nanášania signálnej farby bola vytvorená nastavením PE kanálu na zobrazovanie fluorescencie PE.
2. Z každej komory boli zachytené 3 polia.
3. Po dokončení zobrazovania a počiatočnej analýzy sa pomocou softvéru FCS nastavil prah (log gate) pre pozitívnu a negatívnu transfekciu.
Kontrola kvality kmeňových buniek
Nasledujúci obrázok (obrázok 1) zobrazuje postup terapia kmeňovými bunkami .
Obrázok 1: Postup pri liečbe kmeňovými bunkami
Výsledky:
Stanovenie koncentrácie, životaschopnosti, priemeru a agregácie AdMSC.
Životaschopnosť AdMSC bola stanovená pomocou AO/PI. Postup dvojfarebnej aplikácie bol vytvorený nastavením zeleného kanála a červeného kanála na zobrazenie fluorescencie AO a PI plus svetlé pole.Príklady obrázkov sú znázornené na obrázku 2.
Obrázok 2. Obrázky pred transportom a po transporte AdMSC.A. Pred prepravou;zobrazí sa reprezentatívny obrázok.B. Po preprave;zobrazí sa reprezentatívny obrázok.
Životaschopnosť AdMSC sa po preprave drasticky zmenila v porovnaní s pred prepravou.Životaschopnosť pred prepravou bola 92 %, ale po preprave sa znížila na 71 %.Výsledok je znázornený na obrázku 3.
Obrázok 3. Výsledky životaschopnosti AdMSC (pred prepravou a po preprave)
Priemer a agregácia boli tiež určené Countstar Rigel.Priemer AdMSC sa po preprave drasticky zmenil v porovnaní s pred prepravou.Priemer pred transportom bol 19 um, ale po transporte sa zvýšil na 21 um.Agregácia pred prepravou bola 20 %, ale po preprave sa zvýšila na 25 %.Z obrázkov zachytených Countstar Rigelom sa fenotyp AdMSC po preprave drasticky zmenil.Výsledky sú znázornené na obrázku 4.
Obrázok 4: Výsledky priemeru a agregácie.Odpoveď: Reprezentatívne obrázky AdMSC, fenotyp AdMSC sa po preprave drasticky zmenil.B: Agregácia pred prepravou bola 20 %, ale po preprave sa zvýšila na 25 %.C: Priemer pred transportom bol 19 um, ale po transporte sa zvýšil na 21 um.
Určite imunofenotyp AdMSC pomocou Countstar Rigel
Imunofenotyp AdMSC sa určil pomocou Countstar Rigel, AdMSC sa inkubovali s rôznymi protilátkami (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).Procedúra aplikácie signálnej farby bola vytvorená nastavením zeleného kanála na zobrazenie fluorescencie PE plus svetlého poľa.Referenčná segmentácia obrazu v jasnom poli sa použila ako maska na vzorkovanie PE fluorescenčného signálu.Ukázali sa výsledky CD105 (obrázok 5).
Obrázok 5: CD105 výsledky AdMSC boli stanovené pomocou Countstar Rigel.A: Kvantitatívna analýza pozitívneho percenta CD105 v rôznych vzorkách pomocou softvéru FCS express 5 plus.B: Vysokokvalitné obrázky poskytujú dodatočné morfologické informácie.C: Overené výsledky pomocou miniatúr každej jednej bunky, softvérové nástroje FCS rozdelili bunky do rôznych skupín podľa ich rôznej expresie proteínov.
Ďalšie výsledky protilátok sú znázornené na obr
Obrázok 6: A: Reprezentatívny obraz ASC s typickou vretenovitou morfológiou.Zachytené mikroskopom OLYMPUS.Pôvodné zväčšenie, (10x).B: Adipogénna diferenciácia ASC je dokázaná farbením ruténiovou červenou, ktoré ukazuje oblasti mineralizácie.Zachytené mikroskopom OLYMPUS.Pôvodné zväčšenie (10x).C: Countstar FL charakterizácia ASC.
Zhrnutie:
Countstar FL môže monitorovať koncentráciu, životaschopnosť a fenotypové charakteristiky (a ich zmeny) počas produkcie a diferenciácie týchto kmeňových buniek.FCS express poskytuje funkciu na preskúmanie každej signálnej bunky a overenie údajov prostredníctvom obrázka.Používateľ môže mať tiež istotu, že vykoná ďalšie experimenty na základe výsledkov Countstar Rigel.Countstar Rigel ponúka rýchlu, sofistikovanú a spoľahlivú metódu kontroly kvality kmeňových buniek.
