Mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC) sa často spracovávajú tak, aby sa oddelili od plnej krvi centrifugáciou v hustotnom gradiente.Tieto bunky pozostávajú z lymfocytov (T bunky, B bunky, NK bunky) a monocytov, bežne používaných v oblasti imunológie, bunkovej terapie, infekčných chorôb a vývoja vakcín.Monitorovanie a analýza životaschopnosti a koncentrácie PBMC je rozhodujúca pre klinické laboratóriá, základný lekársky vedecký výskum a produkciu imunitných buniek.
Obr. 1. Izolované PBMC z čerstvej krvi centrifugáciou s hustotným gradientom
AOPI Dual-fluoresces counting je typ testu používaný na detekciu bunkovej koncentrácie a životaschopnosti.Roztok je kombináciou akridínovej oranžovej (zeleno-fluorescenčné farbivo nukleovej kyseliny) a propídiumjodidu (červeno fluoreskujúce farbivo nukleovej kyseliny).Propidium jodid (PI) je membránové vylučovacie farbivo, ktoré vstupuje len do buniek s poškodenými membránami, zatiaľ čo akridínová oranž je schopná preniknúť do všetkých buniek v populácii.Keď sú v jadre prítomné obe farbivá, propídiumjodid spôsobí zníženie fluorescencie akridínovej oranže prenosom fluorescenčnej rezonančnej energie (FRET).Výsledkom je, že bunky s jadrami s neporušenými membránami sa farbia fluorescenčne na zeleno a počítajú sa ako živé, zatiaľ čo bunky s jadrami s narušenými membránami sa farbia iba fluorescenčnou červenou farbou a pri použití systému Countstar® FL sa počítajú ako mŕtve.Materiál bez jadier, ako sú červené krvinky, krvné doštičky a zvyšky, nefluoreskujú a softvér Countstar® FL ich ignoruje.
Experimentálny postup:
1. Zrieďte vzorku PBMC na 5 rôznych koncentrácií pomocou PBS;
2. Pridajte 12 µl roztoku AO/PI do 12 µl vzorky, jemne premiešajte pipetou;
3. Natiahnite 20 ul zmesi do podložného sklíčka;
4. Nechajte bunky usadiť sa v komore približne 1 minútu;
5. Nasaďte sklíčko do prístroja Countstar FL;
6. Zvoľte test „AO/PI Viability“ a potom ho otestujte pomocou Countstar FL.
Upozornenie: AO a PI sú potenciálny karcinogén.Obsluhe sa odporúča nosiť osobné ochranné prostriedky (OOP), aby sa zabránilo priamemu kontaktu s pokožkou a očami.
výsledok:
1. Jasné pole a fluorescenčné snímky PBMC
Farbivo AO a PI sú oba škvrny DNA v bunkovom jadre buniek.Preto krvné doštičky, červené krvinky alebo bunkové zvyšky nie sú schopné ovplyvniť koncentráciu a výsledok životaschopnosti PBMC.Živé bunky, mŕtve bunky a úlomky možno ľahko rozlíšiť na základe obrázkov generovaných Countstar FL (obrázok 1).
Obrázok 2. Jasné pole a fluorescenčné snímky PBMC
2. Koncentrácia a životaschopnosť PBMC
Vzorky PBMC sa zriedili 2, 4, 8 a 16-krát s PBS, potom sa tieto vzorky inkubovali so zmesou farbív AO/PI a analyzovali sa pomocou Countstar FL.Výsledok koncentrácie a životaschopnosti PBMC je znázornený na obrázku nižšie:
