Analýza leukocytov v plnej krvi je rutinným testom v klinickom laboratóriu alebo krvnej banke.Koncentrácia a životaschopnosť leukocytov sú vitálnym indexom ako kontrola kvality skladovania krvi.Okrem leukocytov obsahuje celá krv veľké množstvo krvných doštičiek, červených krviniek alebo bunkových zvyškov, ktoré znemožňujú analyzovať plnú krv priamo pod mikroskopom alebo počítačom buniek v jasnom poli.Bežné metódy na počítanie bielych krviniek zahŕňajú proces lýzy červených krviniek, ktorý je časovo náročný.
AOPI Dual-fluoresces counting je typ testu používaný na detekciu bunkovej koncentrácie a životaschopnosti.Roztok je kombináciou akridínovej oranžovej (zeleno-fluorescenčné farbivo nukleovej kyseliny) a propídiumjodidu (červeno fluoreskujúce farbivo nukleovej kyseliny).Propidium jodid (PI) je membránové vylučovacie farbivo, ktoré vstupuje len do buniek s poškodenými membránami, zatiaľ čo akridínová oranž je schopná preniknúť do všetkých buniek v populácii.Keď sú v jadre prítomné obe farbivá, propídiumjodid spôsobí zníženie fluorescencie akridínovej oranže prenosom fluorescenčnej rezonančnej energie (FRET).Výsledkom je, že bunky s jadrami s neporušenými membránami sa farbia fluorescenčne zelenou farbou a počítajú sa ako živé, zatiaľ čo bunky s jadrami s narušenými membránami sa farbia iba fluorescenčnou červenou farbou a pri použití systému Countstar® Rigel sa počítajú ako mŕtve.
Countstar Rigel je ideálnym riešením pre mnoho komplexných testov charakterizácie bunkovej populácie, ktoré umožňujú rýchlu analýzu bielych krviniek v plnej krvi.
Experimentálny postup:
1.Odoberte 20 µl vzorky krvi a zrieďte vzorku v 180 µl PBS.
2. Pridajte 12 µl roztoku AO/PI do 12 µl vzorky, jemne premiešajte pipetou;
3. Natiahnite 20 ul zmesi do podložného sklíčka;
4. Nechajte bunky usadiť sa v komore približne 1 minútu;
5. Nasaďte sklíčko do prístroja Countstar FL;
6. Vyberte test „AO/PI Viability“ a potom zadajte ID vzorky pre túto vzorku.
7. Zvoľte Dilution ratio, Cell Type, kliknutím na 'Run' (Spustiť) spustite test.
Upozornenie: AO a PI sú potenciálny karcinogén.Obsluhe sa odporúča nosiť osobné ochranné prostriedky (OOP), aby sa zabránilo priamemu kontaktu s pokožkou a očami.
výsledok:
1. Bright Field Obrázok plnej krvi
Na snímke celej krvi vo svetlom poli nie sú medzi červenými krvinkami viditeľné biele krvinky.(Postava 1)
Obrázok 1 Svetlý obraz plnej krvi.
2. Fluorescenčný obraz celej krvi
Farbivo AO a PI sú oba škvrny DNA v bunkovom jadre buniek.Preto krvné doštičky, červené krvinky alebo bunkové zvyšky nie sú schopné ovplyvniť koncentráciu leukocytov a výsledok životaschopnosti.Živé leukocyty (zelená) a mŕtve leukocyty (červená) sú na fluorescenčných snímkach ľahko vizualizovateľné.(Obrázok 2)
Obrázok 2 Fluorescenčné snímky plnej krvi.(A).Obrázok kanála AO;(B) obraz PI kanála;(C) Zlúčte obrázky kanála AO a PI.
3. Koncentrácia a životaschopnosť leukocytov
Softvér Countstar FL automaticky počíta bunky troch sekcií komory a vypočíta priemernú hodnotu celkového počtu buniek WBC (1202), koncentráciu (1,83 x 106 buniek/ml) a % životaschopnosti (82,04 %).Obrázky a údaje plnej krvi je možné jednoducho exportovať ako PDF, obrázok alebo Excel na ďalšiu analýzu alebo archiváciu údajov.
Obrázok 3 Snímka obrazovky softvéru Countstar Rigel
