Mononuklearne celice periferne krvi (PBMC) se pogosto obdelajo, da se ločijo od polne krvi s centrifugiranjem z gradientom gostote.Te celice so sestavljene iz limfocitov (celice T, B celice, NK celice) in monocitov, ki se običajno uporabljajo na področju imunologije, celične terapije, nalezljivih bolezni in razvoja cepiv.Spremljanje in analiza sposobnosti preživetja in koncentracije PBMC je ključnega pomena za klinične laboratorije, osnovne medicinske znanstvene raziskave in proizvodnjo imunskih celic.
Slika 1. Izolirana PBMC iz sveže krvi s centrifugiranjem z gradientom gostote
AOPI dvojno fluorescenčno štetje je vrsta testa, ki se uporablja za odkrivanje koncentracije in sposobnosti preživetja celic.Rešitev je kombinacija akridin oranžne (zeleno-fluorescentno barvanje nukleinske kisline) in propidijevega jodida (rdeča fluorescentna nukleinska kislina).Propidijev jodid (PI) je membransko izločevalno barvilo, ki vstopi le v celice z ogroženimi membranami, medtem ko akridin oranžna lahko prodre v vse celice v populaciji.Kadar sta obe barvili prisotni v jedru, propidijev jodid povzroči zmanjšanje akridinsko oranžne fluorescence s fluorescenčno resonančnim prenosom energije (FRET).Posledično se celice z jedri z nepoškodovanimi membranami obarvajo v fluorescentno zeleno in se štejejo za žive, medtem ko celice z jedri z ogroženimi membranami obarvajo samo fluorescenčno rdeče in se štejejo kot mrtve pri uporabi sistema Countstar® FL.Materiali brez jedra, kot so rdeče krvne celice, trombociti in ostanki, ne fluorescirajo in jih programska oprema Countstar® FL ignorira.
Eksperimentalni postopek:
1. Vzorec PBMC razredčite v 5 različnih koncentracij s PBS;
2. Dodajte 12 µl raztopine AO/PI v 12 µl vzorec, nežno premešajte s pipeto;
3. Potegnite 20 µl mešanice v stekelce komore;
4. Pustite celice, da se usedejo v komori približno 1 minuto;
5. Vstavite diapozitiv v instrument Countstar FL;
6.Izberite test “AO/PI Viability” in ga nato preizkusite pri Countstar FL.
Pozor: AO in PI sta potencialna rakotvorna snov.Priporočljivo je, da upravljavec nosi osebno zaščitno opremo (OZO), da se izogne neposrednemu stiku s kožo in očmi.
rezultat:
1. Svetlo polje in fluorescenčne slike PBMC
Barvilo AO in PI obarvata DNK v celičnem jedru celic.Zato trombociti, rdeče krvne celice ali celični ostanki ne morejo vplivati na koncentracijo PBMC in rezultat preživetja.Žive celice, mrtve celice in ostanke je mogoče zlahka razlikovati na podlagi slik, ki jih ustvari Countstar FL (slika 1).
Slika 2. Slike svetlega polja in fluorescence PBMC
2. Koncentracija in sposobnost preživetja PBMC
Vzorce PBMC smo razredčili 2, 4, 8 in 16-krat s PBS, nato smo te vzorce inkubirali z mešanico barvil AO/PI in analizirali s Countstar FL.Rezultat koncentracije in sposobnosti preživetja PBMC je prikazan na spodnji sliki:
