Qelizat mononukleare të gjakut periferik (PBMCs) shpesh përpunohen për t'u ndarë nga gjaku i plotë me anë të centrifugimit të gradientit të densitetit.Këto qeliza përbëhen nga limfocitet (qelizat T, qelizat B, qelizat NK) dhe monocitet, të përdorura zakonisht në fushën e imunologjisë, terapisë qelizore, sëmundjeve infektive dhe zhvillimit të vaksinave.Monitorimi dhe analizimi i qëndrueshmërisë dhe përqendrimit të PBMC është thelbësor për laboratorët klinikë, kërkimin bazë të shkencës mjekësore dhe prodhimin e qelizave imune.
Fig 1. PBMC e izoluar nga gjaku i freskët me centrifugim me gradient të dendësisë
AOPI Numërimi i dyfishtë fluoresces është lloji i analizës që përdoret për zbulimin e përqendrimit dhe qëndrueshmërisë së qelizave.Zgjidhja është kombinimi i akridinës portokalli (njolla e acidit nukleik jeshil-fluoreshente) dhe jodidi propidium (njolla e acidit nukleik me fluoreshente të kuqe).Jodidi i Propidiumit (PI) është një ngjyrues përjashtues i membranës që hyn vetëm në qelizat me membrana të dëmtuara, ndërsa akridina portokalli është në gjendje të depërtojë në të gjitha qelizat e një popullate.Kur të dyja ngjyrat janë të pranishme në bërthamë, jodidi i propidiumit shkakton një reduktim të fluoreshencës portokalli të akridinës nga transferimi i energjisë së rezonancës fluoreshente (FRET).Si rezultat, qelizat me bërthama me membrana të paprekura ngjyrosin ngjyrën e gjelbër fluoreshente dhe numërohen si të gjalla, ndërsa qelizat me bërthama me membrana të dëmtuara njollosin vetëm ngjyrën e kuqe fluoreshente dhe llogariten si të vdekura kur përdorin sistemin Countstar® FL.Materiali pa bërthama si qelizat e kuqe të gjakut, trombocitet dhe mbeturinat nuk fluoreshenojnë dhe injorohen nga softueri Countstar® FL.
Procedurë eksperimentale:
1. Holloni kampionin PBMC në 5 përqendrime të ndryshme me PBS;
2. Shtoni 12µl tretësirë AO/PI në kampionin 12µl, të përziera butësisht me pipetë;
3. Tërhiqeni 20 µl përzierje në rrëshqitjen e dhomës;
4.Lërini qelizat të vendosen në dhomë për rreth 1 minutë;
5.Insektoni rrëshqitjen në instrumentin Countstar FL;
6. Zgjidhni analizën “AO/PI Viability”, më pas testoni nga Countstar FL.
Kujdes: AO dhe PI janë kancerogjen potencial.Rekomandohet që operatori të mbajë pajisje mbrojtëse personale (PPE) për të shmangur kontaktin e drejtpërdrejtë me lëkurën dhe sytë.
Rezultati:
1. Imazhet e fushës së ndritshme dhe fluoreshencës të PBMC
Bojërat AO dhe PI janë të dyja njollat e ADN-së në bërthamën qelizore të qelizave.Prandaj, trombocitet, qelizat e kuqe të gjakut ose mbeturinat qelizore nuk janë në gjendje të ndikojnë në përqendrimin dhe qëndrueshmërinë e PBMC-ve.Qelizat e gjalla, qelizat e vdekura dhe mbeturinat mund të dallohen lehtësisht bazuar në imazhet e krijuara nga Countstar FL (Figura 1).
Figura 2. Imazhet e fushës së ndritshme dhe fluoreshencës të PBMC
2.Përqendrimi dhe qëndrueshmëria e PBMC
Mostrat PBMC u holluan në 2, 4, 8 dhe 16 herë me PBS, më pas ato mostra u inkubuan me një përzierje ngjyrash AO/PI dhe u analizuan përkatësisht nga Countstar FL.Rezultati i përqendrimit dhe qëndrueshmërisë së PBMC tregohet si më poshtë:
