Sél mononuklear getih periferal (PBMCs) mindeng diolah pikeun misahkeun tina sakabeh getih ku centrifugation gradién dénsitas.Éta sél-sél téh diwangun ku limfosit (sél T, sél B, sél NK) jeung monosit, ilahar dipaké dina widang imunologi, terapi sél, kasakit inféksi jeung ngembangkeun vaksin.Ngawaskeun sareng nganalisa viability sareng konsentrasi PBMC penting pisan pikeun laboratorium klinis, panalungtikan élmu médis dasar sareng produksi sél imun.
Gbr 1. PBMC terasing tina getih seger jeung Density gradién centrifugation
AOPI Dual-fluoresces cacah nyaéta tipe assay dipaké pikeun detecting konsentrasi sél jeung viability.Solusina nyaéta kombinasi jeruk acridine (noda asam nukléat héjo-fluoresensi) sareng propidium iodide (noda asam nukléat beureum-fluoresensi).Propidium iodide (PI) nyaéta pewarna pangaluaran mémbran nu ngan asup kana sél nu mémbran kompromi, sedengkeun jeruk acridine bisa nembus sakabéh sél dina populasi.Nalika duanana pewarna aya dina inti, propidium iodide nyababkeun pangurangan fluoresensi jeruk acridine ku transfer énergi résonansi fluoresensi (FRET).Hasilna, sél nukléasi jeung mémbran gembleng ngawarnaan héjo fluoresensi tur diitung salaku hirup, sedengkeun sél nucleated kalawan mémbran kompromi ngan ngawarnaan beureum fluoresensi sarta diitung salaku maot nalika ngagunakeun sistem Countstar® FL.Bahan non-inti sapertos sél getih beureum, trombosit sareng lebu henteu fluoresensi sareng teu dipaliré ku parangkat lunak Countstar® FL.
Prosedur ékspérimén:
1. Éncér sampel PBMC kana 5 konsentrasi béda jeung PBS;
2.Tambahkeun 12μl AO/PI solusi kana 12μl sampel, gently dicampurkeun jeung pipette;
3. Tarik 20µl campuran kana chamber slide;
4.Allow sél ka settle di chamber pikeun sabudeureun 1 menit;
5. Serangga slide kana alat Countstar FL;
6. Pilih "AO / PI Viability" assay, teras uji ku Countstar FL.
Awas: AO sareng PI mangrupikeun karsinogen poténsial.Disarankeun yén operator nganggo alat pelindung pribadi (PPE) pikeun nyegah kontak langsung sareng kulit sareng panon.
Hasilna:
1.Bright Field na gambar Fluoresensi tina PBMC
Pewarna AO sareng PI duanana ngawarnaan DNA dina inti sél sél.Ku alatan éta, Platélét, sél getih beureum, atawa lebu sélular teu bisa mangaruhan konsentrasi PBMCs jeung hasil viability.Sél hirup, sél maot jeung lebu bisa gampang dibédakeun dumasar kana gambar dihasilkeun ku Countstar FL (Gambar 1).
Gambar 2．Bright Field jeung Gambar Fluoresensi PBMC
2.Konsentrasi jeung Viability of PBMC
Sampel PBMC diencerkeun dina 2, 4, 8 sareng 16 kali sareng PBS, teras éta sampel diinkubasi ku campuran pewarna AO / PI sareng dianalisis ku Countstar FL masing-masing.Hasil konséntrasi jeung viabilitas PBMC ditémbongkeun saperti gambar di handap ieu:
