Abstrakt: Mesenkymala stamceller är en undergrupp av pluripotenta stamceller som kan isoleras från mesodermen.Med sin förnyelse av självreplikering och differentiering i flera riktningar har de en hög potential för olika terapier inom medicin.Mesenkymala stamceller har en unik immunfenotyp och immunregleringsförmåga.Därför används mesenkymala stamceller redan i stor utsträckning vid stamcellstransplantationer, vävnadsteknik och organtransplantation.Och utöver dessa applikationer används de som ett idealiskt verktyg inom vävnadsteknik som såceller i en serie grundläggande och kliniska forskningsexperiment.Hittills finns det ingen allmänt accepterad metod och standard för kvalitetskontroll av mesenkymala stamceller.Countstar Rigel kan övervaka koncentrationen, livsdugligheten och fenotypegenskaperna (och deras förändringar) under produktionen och differentieringen av dessa stamceller.Countstar Rigel har också fördelen att erhålla ytterligare morfologisk information, tillhandahållen av de permanenta ljusfälts- och fluorescensbaserade bildinspelningarna under hela processen med cellkvalitetsövervakning.Countstar Rigel erbjuder en snabb, sofistikerad och pålitlig metod för kvalitetskontroll av stamceller.
Material och metoder:
Fetthärledda mesenkymala stamceller (AdMSCs) gavs av professor Nianmin Qi, AO/PI-färgningslösning (Shanghai RuiYu, CF002).Antikropp: CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLADR (BD Company).
AdMSCs odlades i en 37 ℃, 5 % CO2 fuktad inkubator.Smält med trypsin före användning.
CD-markörfärgningsproceduren följdes som manual för antikropp.
CD-markördetektering med Countstar Rigel:
1. En signal-färgappliceringsprocedur skapades genom att ställa in PE-kanalen till bild-PE-fluorescens.
2. 3 fält infångades från varje kammare.
3. Efter att avbildningen och den initiala analysen var klar, ställdes tröskelvärdet (log gate) inställningen för positiv och negativ transfektion av FCS-programvaran.
Kvalitetskontroll av stamceller
Följande figur (Figur 1) visar proceduren för stamcellsterapi .
Figur 1: Proceduren för stamcellsterapi
Resultat:
Fastställande av koncentration, viabilitet, diameter och aggregering av AdMSCs.
Viabiliteten för AdMSCs bestämdes av AO/PI. En appliceringsprocedur med två färger skapades genom att ställa in grön kanal och röd kanal till bild AO- och PI-fluorescens, plus ett ljust fält.Exempelbilder visades i figur 2.
Figur 2. Bilder på före transport och efter transport av AdMSCs.A. Före transport;en representativ bild visas.B. Efter transport;en representativ bild visas.
Viabiliteten för AdMSCs förändrades drastiskt efter transport jämfört med före transport.Viabiliteten före transport var 92 %, men den minskade till 71 % efter transport.Resultatet visades i figur 3.
Figur 3. Viabilitetsresultaten för AdMSCs (före transport och efter transport)
Diametern och aggregeringen bestämdes också av Countstar Rigel.Diametern på AdMSCs ändrades drastiskt efter transport jämfört med före transport.Diametern före transport var 19 µm, men den ökade till 21 µm efter transport.Aggregeringen av före transport var 20 %, men den ökade till 25 % efter transport.Från bilderna som tagits av Countstar Rigel ändrades fenotypen av AdMSCs drastiskt efter transport.Resultaten visades i figur 4.
Figur 4: Diametern och aggregeringsresultaten.S: De representativa bilderna av AdMSCs, fenotypen av AdMSCs, ändrades drastiskt efter transport.B: Aggregeringen före transport var 20 %, men den ökade till 25 % efter transport.C: Diametern före transport var 19 µm, men den ökade till 21 µm efter transport.
Bestäm immunfenotypen av AdMSCs av Countstar Rigel
Immunfenotypen av AdMSCs bestämdes av Countstar Rigel, AdMSCs inkuberades med olika antikroppar (CD29, CD34, CD45, CD56, CD73, CD105, HLA-DR).En signal-färg appliceringsprocedur skapades genom att ställa in en grön kanal för att avbilda PE-fluorescens, plus ett ljust fält.Ljusfältsbildreferenssegmentering applicerades som en mask för att prova PE-fluorescenssignalen.Resultaten av CD105 visades (Figur 5).
Figur 5: CD105-resultat av AdMSCs bestämdes av Countstar Rigel.S: Kvantitativ analys av den positiva procentandelen CD105 i olika prover med FCS express 5 plus-programvara.B: Bilder av hög kvalitet ger ytterligare morfologisk information.C: Validerade resultat med miniatyrbilder av varje enskild cell, FCS-programvaruverktygen delade upp cellerna i olika grupper enligt deras varierande proteinuttryck.
Andra antikroppsresultat visades i fig 6
Figur 6: A: En representativ bild av ASC:er med typisk spindelformad morfologi.Fångad med OLYMPUS mikroskop.Originalförstoring, (10x).B: Adipogen differentiering av ASC:er bevisas av Ruthenium Red-färgning som visar områden med mineralisering.Fångad med OLYMPUS mikroskop.Originalförstoring (10x).C: Countstar FL karakterisering av ASC:er.
Sammanfattning:
Countstar FL kan övervaka koncentrationen, viabiliteten och fenotypegenskaperna (och deras förändringar) under produktionen och differentieringen av dessa stamceller.FCS express tillhandahåller funktionen för att granska varje signalcell, validera data genom bilden.Användaren kan också ha förtroendet att utföra nästa experiment baserat på Countstar Rigel-resultat.Countstar Rigel erbjuder en snabb, sofistikerad och pålitlig metod för kvalitetskontroll av stamceller.
