การวิเคราะห์เม็ดเลือดขาวในเลือดครบส่วนเป็นการทดสอบตามปกติในห้องปฏิบัติการทางคลินิกหรือธนาคารเลือดความเข้มข้นและความมีชีวิตของเม็ดเลือดขาวเป็นดัชนีสำคัญในการควบคุมคุณภาพของการเก็บเลือดนอกจากเม็ดเลือดขาวแล้ว เลือดครบส่วนยังมีเกล็ดเลือด เซลล์เม็ดเลือดแดง หรือเศษเซลล์จำนวนมาก ซึ่งทำให้ไม่สามารถวิเคราะห์เลือดครบส่วนได้โดยตรงภายใต้กล้องจุลทรรศน์หรือตัวนับเซลล์ฟิลด์ที่สว่างวิธีการทั่วไปในการนับจำนวนเม็ดเลือดขาวนั้นเกี่ยวข้องกับกระบวนการสลาย RBC ซึ่งใช้เวลานาน
การนับฟลูออเรสเซนต์คู่ของ AOPI เป็นประเภทการทดสอบที่ใช้สำหรับตรวจจับความเข้มข้นและความมีชีวิตของเซลล์สารละลายคือการรวมกันของสีส้ม acridine (คราบกรดนิวคลีอิกเรืองแสงสีเขียว) และโพรพิเดียมไอโอไดด์ (คราบกรดนิวคลีอิกเรืองแสงสีแดง)โพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) เป็นสีย้อมเพื่อการแยกเมมเบรนที่เข้าสู่เซลล์ที่มีเยื่อหุ้มเซลล์ที่ถูกบุกรุกเท่านั้น ในขณะที่ส้มอะคริดีนสามารถเจาะเซลล์ทั้งหมดในประชากรได้เมื่อสีย้อมทั้งสองมีอยู่ในนิวเคลียส โพรพิเดียมไอโอไดด์จะทำให้การเรืองแสงสีส้มของอะคริดีนลดลงโดยการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสง (FRET)ผลที่ได้คือ เซลล์นิวคลีเอตที่มีเยื่อหุ้มที่ไม่เสียหายจะย้อมสีเขียวเรืองแสงและนับเป็นเซลล์ที่มีชีวิต ในขณะที่เซลล์นิวคลีเอตที่มีเยื่อหุ้มเซลล์ที่ถูกทำลายจะย้อมด้วยสีแดงเรืองแสงเท่านั้น และจะถูกนับว่าตายเมื่อใช้ระบบ Countstar® Rigel
Countstar Rigel เป็นโซลูชันในอุดมคติสำหรับการวิเคราะห์ลักษณะประชากรเซลล์ที่ซับซ้อนจำนวนมาก ทำให้สามารถวิเคราะห์เซลล์เม็ดเลือดขาวในเลือดครบส่วนได้อย่างรวดเร็ว
ขั้นตอนการทดลอง:
1. นำตัวอย่างเลือด 20 µl และเจือจางตัวอย่างใน 180 µl ของ PBS
2. เติมสารละลาย AO/PI 12µl ลงในตัวอย่าง 12µl ค่อยๆ ผสมกับปิเปต
3. วาดส่วนผสม 20µl ลงในสไลด์ห้อง
4.ปล่อยให้เซลล์ตั้งถิ่นฐานในห้องเพาะเลี้ยงประมาณ 1 นาที
5.แมลงสไลด์ลงในเครื่องดนตรี Countstar FL;
6. เลือกการทดสอบ "AO/PI Viability" จากนั้นป้อน ID ตัวอย่างสำหรับตัวอย่างนี้
7. เลือกอัตราส่วนการเจือจาง ประเภทเซลล์ คลิก 'เรียกใช้' เพื่อเริ่มการทดสอบ
ข้อควรระวัง: AO และ PI เป็นสารก่อมะเร็งขอแนะนำให้ผู้ปฏิบัติงานสวมอุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (PPE) เพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้สัมผัสกับผิวหนังและดวงตาโดยตรง
ผลลัพธ์:
1. Bright Field Image ของเลือดครบส่วน
ในภาพช่องสว่างของเลือดครบส่วน WBC จะไม่ปรากฏให้เห็นในเซลล์เม็ดเลือดแดง(รูปที่ 1)
รูปที่ 1 ภาพสนามสว่างของเลือดครบส่วน
2. ภาพเรืองแสงของเลือดครบส่วน
สีย้อม AO และ PI เป็นทั้งคราบ DNA ในนิวเคลียสของเซลล์ของเซลล์ดังนั้นเกล็ดเลือด เซลล์เม็ดเลือดแดง หรือเศษเซลล์จึงไม่ส่งผลต่อความเข้มข้นของเม็ดเลือดขาวและผลการมีชีวิตเม็ดเลือดขาวที่มีชีวิต (สีเขียว) และเม็ดเลือดขาวที่ตายแล้ว (สีแดง) จะมองเห็นได้ง่ายในภาพเรืองแสง(รูปที่ 2)
รูปที่ 2 ภาพเรืองแสงของเลือดครบส่วน(เอ).ภาพของช่อง AO;(B) รูปภาพของ PI Channel;(C) รวมภาพของ AO และ PI Channel
3. ความเข้มข้นและความมีชีวิตของเม็ดเลือดขาว
ซอฟต์แวร์ Countstar FL นับเซลล์ของส่วนห้องสามส่วนโดยอัตโนมัติ และคำนวณค่าเฉลี่ยของจำนวนเซลล์ WBC ทั้งหมด (1202), ความเข้มข้น (1.83 x 106 เซลล์/มล.) และ % ความมีชีวิต (82.04%)รูปภาพและข้อมูลของเลือดครบส่วนสามารถส่งออกได้อย่างง่ายดายในรูปแบบ PDF, รูปภาพ หรือ Excel สำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติมหรือการเก็บถาวรข้อมูล
รูปที่ 3 ภาพหน้าจอของ Countstar Rigel Software
