Ang mga peripheral blood mononuclear cells (PBMC) ay kadalasang pinoproseso upang humiwalay sa buong dugo sa pamamagitan ng density gradient centrifugation.Ang mga cell na iyon ay binubuo ng mga lymphocytes (T cells, B cells, NK cells) at monocytes, na karaniwang ginagamit sa larangan ng immunology, cell therapy, nakakahawang sakit at pagbuo ng bakuna.Ang pagsubaybay at pagsusuri ng posibilidad at konsentrasyon ng PBMC ay mahalaga para sa mga klinikal na laboratoryo, pangunahing pananaliksik sa agham medikal at produksyon ng immune cell.
Fig 1. Nakahiwalay na PBMC mula sa sariwang dugo na may Density gradient centrifugation
Ang AOPI Dual-fluoresces counting ay ang uri ng assay na ginagamit para sa pag-detect ng cell concentration at viability.Ang solusyon ay kumbinasyon ng acridine orange (ang green-fluorescent nucleic acid stain) at propidium iodide (ang red-fluorescent nucleic acid stain).Ang propidium iodide (PI) ay isang membrane exclusion dye na pumapasok lamang sa mga cell na may mga nakompromisong lamad, habang ang acridine orange ay kayang tumagos sa lahat ng mga cell sa isang populasyon.Kapag ang parehong mga tina ay naroroon sa nucleus, ang propidium iodide ay nagdudulot ng pagbawas sa acridine orange fluorescence sa pamamagitan ng fluorescence resonance energy transfer (FRET).Bilang resulta, ang mga nucleated na cell na may buo na lamad ay nabahiran ng fluorescent na berde at binibilang bilang live, samantalang ang mga nucleated na cell na may mga nakompromisong lamad ay nagpapalamlam lamang ng fluorescent na pula at binibilang na patay kapag ginagamit ang Countstar® FL system.Ang non-nucleated na materyal gaya ng mga red blood cell, platelet at debris ay hindi nag-fluoresce at hindi pinapansin ng Countstar® FL software.
Eksperimental na Pamamaraan:
1. Dilute ang sample ng PBMC sa 5 magkakaibang konsentrasyon na may PBS;
2. Magdagdag ng 12µl AO/PI solution sa 12µl sample, dahan-dahang hinaluan ng pipette;
3. Gumuhit ng 20µl mixture sa chamber slide;
4. Payagan ang mga cell na manirahan sa silid sa loob ng 1 minuto;
5. Insekto ang slide sa instrumento ng Countstar FL;
6. Piliin ang "AO/PI Viability" assay, pagkatapos ay subukan ng Countstar FL.
Babala: Ang AO at PI ay isang potensyal na carcinogen.Inirerekomenda na ang operator ay magsuot ng personal protective equipment (PPE) upang maiwasan ang direktang pagkakadikit sa balat at mata.
Resulta:
1.Bright Field at Fluorescence na mga larawan ng PBMC
Ang AO at PI dye ay parehong mantsa ng DNA sa cell nucleus ng mga cell.Samakatuwid, ang mga platelet, pulang selula ng dugo, o cellular debris ay hindi makakaapekto sa konsentrasyon at resulta ng viability ng PBMC.Ang mga buhay na selula, mga patay na selula at mga labi ay madaling makilala batay sa mga imahe na nabuo ng Countstar FL (Larawan 1).
Figure 2．Bright Field at Fluorescence na mga larawan ng PBMC
2.Konsentrasyon at Viability ng PBMC
Ang mga sample ng PBMC ay natunaw sa 2, 4, 8 at 16 na beses sa PBS, pagkatapos ang mga sample na iyon ay natupok ng isang AO / PI dye mixture at sinuri ng Countstar FL ayon sa pagkakabanggit.Ang resulta ng konsentrasyon at posibilidad na mabuhay ng PBMC ay ipinakita sa ibaba ng figure:
