Tam kandaki lökositlerin analizi, klinik laboratuvarda veya kan bankasında rutin bir testtir.Lökositlerin konsantrasyonu ve canlılığı, kan depolamanın kalite kontrolü olarak hayati göstergedir.Lökosit dışında, tam kan çok sayıda trombosit, kırmızı kan hücresi veya hücresel kalıntı içerir, bu da tam kanın doğrudan mikroskop veya parlak alan hücre sayacı altında analiz edilmesini imkansız hale getirir.Beyaz kan hücrelerini saymak için geleneksel yöntemler, zaman alıcı olan RBC liziz sürecini içerir.
AOPI Çift floresan sayımı, hücre konsantrasyonunu ve canlılığını saptamak için kullanılan tahlil tipidir.Çözüm, akridin portakalı (yeşil-floresan nükleik asit boyası) ve propidium iyodür (kırmızı-floresan nükleik asit boyası) kombinasyonudur.Propidium iyodür (PI), akridin portakalı bir popülasyondaki tüm hücrelere nüfuz edebilirken, yalnızca zarları bozulmuş hücrelere giren bir zar dışlama boyasıdır.Çekirdekte her iki boya da bulunduğunda, propidyum iyodür, flüoresans rezonans enerji transferi (FRET) ile akridin turuncu flüoresansında bir azalmaya neden olur.Sonuç olarak, zarları sağlam olan çekirdekli hücreler floresan yeşili boyar ve canlı olarak sayılırken, zarları bozulmuş çekirdekli hücreler yalnızca floresan kırmızısını boyar ve Countstar® Rigel sistemini kullanırken ölü olarak sayılır.
Countstar Rigel, birçok karmaşık hücre popülasyonu karakterizasyon tahlili için ideal bir çözüm olup, tam kandaki beyaz kan hücrelerinin hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar.
Deneysel prosedür:
1.20 µl kan numunesi alın ve numuneyi 180 µl PBS içinde seyreltin.
2. 12µl numuneye 12µl AO/PI solüsyonu ekleyin, pipetle hafifçe karıştırın;
3. 20µl karışımı hazne slaytına çekin;
4. Hücrelerin yaklaşık 1 dakika odaya yerleşmesine izin verin;
5. Slaytı Countstar FL cihazına yerleştirin;
6. “AO/PI Viability” testini seçin, ardından bu numune için Numune Kimliğini Girin.
7. Seyreltme oranı, Hücre Tipi'ni seçin, testi başlatmak için 'Çalıştır'ı tıklayın.
Dikkat: AO ve PI potansiyel bir kanserojendir.Operatörün cilt ve gözlerle doğrudan temastan kaçınmak için kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanması önerilir.
Sonuç:
1. Tam kanın Parlak Alan Görüntüsü
Tam kanın parlak alan görüntüsünde, kırmızı kan hücresi arasında WBC'ler görünmez.(Şekil 1)
Şekil 1 Tam kanın parlak alan görüntüsü.
2. Tam kanın floresan görüntüsü
AO ve PI boyası, hücrelerin hücre çekirdeğindeki DNA'yı boyar.Bu nedenle, trombositler, kırmızı kan hücreleri veya hücresel kalıntılar, lökosit konsantrasyonunu ve canlılık sonucunu etkileyemez.Floresan görüntülerinde canlı lökositler (Yeşil) ve ölü lökositler (Kırmızı) kolayca görselleştirilir.(Şekil 2)
Şekil 2 Tam kanın Floresan Görüntüleri.(A).AO Kanalının Görüntüsü;(B) PI Kanalının Görüntüsü;(C) AO ve PI Kanalının görüntülerini birleştirin.
3. Lökositlerin konsantrasyonu ve canlılığı
Countstar FL yazılımı, otomatik olarak üç odacık bölümündeki hücreleri sayar ve toplam WBC hücre sayısı (1202), konsantrasyon (1.83 x 106 hücre/ml) ve canlılık yüzdesinin (%82.04) ortalama değerini hesaplar.Tam kan görüntüleri ve verileri, ek analiz veya veri arşivleme için kolayca PDF, Görüntü veya Excel olarak dışa aktarılabilir.
Şekil 3 Countstar Rigel Yazılımının Ekran Görüntüsü
