Мононуклеарні клітини периферичної крові (МКМК) часто обробляють для відділення від цільної крові шляхом центрифугування з градієнтом щільності.Ці клітини складаються з лімфоцитів (Т-клітин, В-клітин, NK-клітин) і моноцитів, які зазвичай використовуються в області імунології, клітинної терапії, інфекційних захворювань та розробки вакцин.Моніторинг та аналіз життєздатності та концентрації PBMC має вирішальне значення для клінічних лабораторій, фундаментальних медичних наукових досліджень та виробництва імунних клітин.
Рис. 1. Виділений PBMC зі свіжої крові за допомогою центрифугування з градієнтом щільності
Підрахунок AOPI з подвійною флуоресценцією є типом аналізу, який використовується для визначення концентрації та життєздатності клітин.Розчин являє собою комбінацію акридинового оранжевого (зелена флуоресцентна фарба нуклеїнової кислоти) і йодиду пропідію (червона флуоресцентна фарба нуклеїнової кислоти).Йодид пропідію (PI) є барвником для виключення мембрани, який проникає лише в клітини з пошкодженими мембранами, тоді як акридиновий помаранчевий здатний проникати в усі клітини популяції.Коли в ядрі присутні обидва барвники, йодид пропідію викликає зниження флуоресценції акридинового оранжевого кольору за рахунок флуоресцентного резонансного переносу енергії (FRET).В результаті клітини з ядрою з інтактними мембранами фарбуються флуоресцентним зеленим кольором і вважаються живими, тоді як клітини з ядрою з пошкодженими мембранами фарбуються лише у флуоресцентний червоний колір і вважаються мертвими при використанні системи Countstar® FL.Безядерний матеріал, такий як еритроцити, тромбоцити та уламки, не флуоресцує і ігнорується програмним забезпеченням Countstar® FL.
Експериментальна процедура:
1. Розведіть зразок PBMC у 5 різних концентраціях PBS;
2. Додайте 12 мкл розчину AO/PI до 12 мкл зразка, обережно перемішавши піпеткою;
3. Наберіть 20 мкл суміші в предметне стекло;
4. Дайте клітинам відстоятися в камері приблизно на 1 хвилину;
5. Вставте предметне скло в інструмент Countstar FL;
6. Виберіть аналіз «Життєздатність AO/PI», а потім перевірте Countstar FL.
Увага: AO та PI є потенційним канцерогеном.Оператору рекомендується носити засоби індивідуального захисту (ЗІЗ), щоб уникнути прямого контакту зі шкірою та очима.
Результат:
1. Зображення яскравого поля та флуоресценції PBMC
Обидва барвники AO і PI забарвлюють ДНК в клітинному ядрі клітин.Таким чином, тромбоцити, червоні кров’яні тільця або клітинний сміття не можуть впливати на концентрацію PBMC і результат життєздатності.Живі клітини, мертві клітини та уламки можна легко розрізнити на основі зображень, згенерованих Countstar FL (Малюнок 1).
Малюнок 2. Зображення яскравого поля та флуоресценції PBMC
2.Концентрація та життєздатність PBMC
Зразки PBMC розбавляли PBS у 2, 4, 8 та 16 разів, потім ці зразки інкубували із сумішшю барвників AO/PI та аналізували Countstar FL відповідно.Результат концентрації та життєздатності PBMC показаний на малюнку нижче:
