Аналіз лейкоцитів у цільній крові є рутинним аналізом у клінічній лабораторії або банку крові.Концентрація та життєздатність лейкоцитів є життєво важливим показником контролю якості зберігання крові.Крім лейкоцитів, цільна кров містить велику кількість тромбоцитів, еритроцитів або клітинного сміття, що унеможливлює аналіз цільної крові безпосередньо під мікроскопом або лічильником клітин яскравого поля.Звичайні методи підрахунку лейкоцитів включають процес лізису еритроцитів, який займає багато часу.
Підрахунок AOPI з подвійною флуоресценцією є типом аналізу, який використовується для визначення концентрації та життєздатності клітин.Розчин являє собою комбінацію акридинового оранжевого (зелена флуоресцентна фарба нуклеїнової кислоти) і йодиду пропідію (червона флуоресцентна фарба нуклеїнової кислоти).Йодид пропідію (PI) є барвником для виключення мембрани, який проникає лише в клітини з пошкодженими мембранами, тоді як акридиновий помаранчевий здатний проникати в усі клітини популяції.Коли в ядрі присутні обидва барвники, йодид пропідію викликає зниження флуоресценції акридинового оранжевого кольору за рахунок флуоресцентного резонансного переносу енергії (FRET).В результаті клітини з ядрою з інтактними мембранами фарбуються флуоресцентним зеленим кольором і вважаються живими, тоді як клітини з ядрою з пошкодженими мембранами фарбуються лише у флуоресцентний червоний колір і вважаються мертвими при використанні системи Countstar® Rigel.
Countstar Rigel є ідеальним рішенням для багатьох складних аналізів характеристики клітинної популяції, що дозволяє швидко аналізувати лейкоцити цільної крові.
Експериментальна процедура:
1. Візьміть 20 мкл зразка крові та розведіть зразок у 180 мкл PBS.
2. Додайте 12 мкл розчину AO/PI до 12 мкл зразка, обережно перемішавши піпеткою;
3. Наберіть 20 мкл суміші в предметне стекло;
4. Дайте клітинам відстоятися в камері приблизно на 1 хвилину;
5. Вставте предметне скло в інструмент Countstar FL;
6. Виберіть аналіз «Життєздатність AO/PI», потім введіть ідентифікатор зразка для цього зразка.
7. Виберіть коефіцієнт розведення, тип клітини, натисніть «Виконати», щоб почати тест.
Увага: AO та PI є потенційним канцерогеном.Оператору рекомендується носити засоби індивідуального захисту (ЗІЗ), щоб уникнути прямого контакту зі шкірою та очима.
Результат:
1. Яскраве поле Зображення цільної крові
На зображенні в яскравому полі цільної крові лейкоцити не видно серед еритроцитів.(Фігура 1)
Малюнок 1 Зображення цільної крові в яскравому полі.
2. Флуоресцентне зображення цільної крові
Обидва барвники AO і PI забарвлюють ДНК в клітинному ядрі клітин.Таким чином, тромбоцити, червоні кров’яні тільця або клітинні залишки не можуть вплинути на концентрацію лейкоцитів і результат життєздатності.Живі лейкоцити (зелений) і мертві лейкоцити (червоний) легко візуалізуються на флуоресцентних зображеннях.(Малюнок 2)
Малюнок 2 Флуоресцентні зображення цільної крові.(А).Зображення каналу AO;(B) зображення каналу PI;(C) Об'єднайте зображення каналу AO та PI.
3. Концентрація та життєздатність лейкоцитів
Програмне забезпечення Countstar FL автоматично підраховує клітини трьох секцій камер і обчислює середнє значення загальної кількості лейкоцитів (1202), концентрації (1,83 x 106 клітин/мл) і % життєздатності (82,04%).Зображення та дані цільної крові можна легко експортувати у форматі PDF, зображення або Excel для додаткового аналізу або архівування даних.
Малюнок 3 Скріншот програми Countstar Rigel Software
