کینسر سیل ریسرچ میں کاؤنٹ اسٹار کی ایپلی کیشنز

کاؤنٹ اسٹار سسٹم امیج سائٹو میٹر اور سیل کاؤنٹر کو سنگل بینچ ٹاپ انسٹرومنٹ میں جوڑتا ہے۔یہ ایپلیکیشن سے چلنے والا، کمپیکٹ، اور خودکار سیل امیجنگ سسٹم کینسر کے خلیات کی تحقیق کے لیے ایک ہمہ جہت حل فراہم کرتا ہے، جس میں سیل کی گنتی، قابل عمل (AO/PI، ٹریپن بلیو)، apoptosis (Annexin V-FITC/PI)، سیل شامل ہیں۔ سائیکل (PI)، اور GFP/RFP ٹرانسفیکشن۔

خلاصہ

کینسر دنیا بھر میں موت کی اہم وجوہات میں سے ایک ہے، اور کینسر کے علاج کے نئے طریقوں کی ترقی بہت اہمیت کی حامل ہے۔کینسر سیل کینسر کی بنیادی تحقیقی چیز ہے، کینسر سیل سے مختلف معلومات کا جائزہ لینے کی ضرورت ہے۔اس تحقیقی علاقے کو تیز، قابل اعتماد، سادہ اور تفصیلی سیل تجزیہ کی ضرورت ہے۔کاؤنٹ اسٹار سسٹم کینسر کے خلیات کے تجزیہ کے لیے ایک سادہ حل پلیٹ فارم فراہم کرتا ہے۔

کاؤنٹ اسٹار ریگل کے ذریعہ کینسر سیل اپوپٹوس کا مطالعہ کریں۔

اپوپٹوس اسسز کو معمول کے مطابق کئی لیبارٹریوں میں مختلف مقاصد کے لیے سیل ثقافتوں کی صحت کا اندازہ لگانے سے لے کر مرکبات کے پینل کے زہریلے پن کا جائزہ لینے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
Apoptosis پرکھ ایک قسم ہے جو Annexin V-FITC/PI سٹیننگ طریقہ کے ذریعہ خلیوں کے apoptosis فیصد کا تعین کرنے کے لئے استعمال ہوتی ہے۔Annexin V ابتدائی apoptosis سیل یا necrosis cell کے ساتھ فاسفیٹائڈیلسرین (PS) سے منسلک ہوتا ہے۔PI صرف necrotic/انتہائی دیر سے مرحلے کے apoptotic خلیوں میں داخل ہوتا ہے۔(شکل 1)

A: ابتدائی apoptosis Annexin V (+), PI (-)

B: دیر سے اپوپٹوسس اینیکسن V (+)، PI (+)

شکل 1: 293 خلیوں کی کاؤنٹ اسٹار ریگل تصویروں (5 ایکس میگنیفیکیشن) کی توسیع شدہ تفصیلات، انیکسن وی ایف آئی ٹی سی اور پی آئی کے ساتھ علاج کیا گیا

کینسر سیل کا سیل سائیکل تجزیہ

سیل سائیکل یا سیل ڈویژن سائیکل ان واقعات کا سلسلہ ہے جو ایک خلیے میں رونما ہوتا ہے جس کی وجہ سے اس کی تقسیم ہوتی ہے اور اس کے DNA (DNA نقل) کی دو بیٹیوں کے خلیے پیدا ہوتے ہیں۔نیوکلئس والے خلیوں میں، جیسا کہ یوکرائٹس میں، سیل سائیکل کو بھی تین ادوار میں تقسیم کیا جاتا ہے: انٹرفیس، مائٹوٹک (M) مرحلہ، اور سائٹوکینیسس۔پروپیڈیم آئوڈائڈ (PI) ایک جوہری داغ دار رنگ ہے جو سیل سائیکل کی پیمائش کے لیے اکثر استعمال ہوتا ہے۔چونکہ رنگ زندہ خلیوں میں داخل نہیں ہو سکتا، اس لیے داغ لگنے سے پہلے خلیات کو ایتھنول سے ٹھیک کر دیا جاتا ہے۔اس کے بعد تمام خلیات داغدار ہو جاتے ہیں۔تقسیم کی تیاری کرنے والے خلیات ڈی این اے کی بڑھتی ہوئی مقدار پر مشتمل ہوں گے اور متناسب طور پر بڑھی ہوئی فلوروسینس کو ظاہر کریں گے۔فلوروسینس کی شدت میں فرق سیل سائیکل کے ہر مرحلے میں خلیوں کی فیصد کا تعین کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔کاؤنٹ اسٹار تصویر کھینچ سکتا ہے اور نتائج FCS ایکسپریس سافٹ ویئر میں دکھائے جائیں گے۔(شکل 2)

شکل 2: MCF-7 (A) اور 293T (B) کو PI کے ساتھ سیل سائیکل ڈیٹیکشن کٹ کے ساتھ داغ دیا گیا تھا، نتائج کا تعین کاؤنٹ اسٹار ریگل کے ذریعہ کیا گیا تھا، اور FCS ایکسپریس کے ذریعہ تجزیہ کیا گیا تھا۔

سیل میں قابل عمل اور GFP ٹرانسفیکشن کا تعین

بائیو پروسیس کے دوران، GFP کو اکثر ریکومبیننٹ پروٹین کے ساتھ ایک اشارے کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔GFP فلوروسینٹ کا تعین کریں ہدف پروٹین اظہار کی عکاسی کر سکتے ہیں.Countstar Rigel GFP ٹرانسفیکشن کے ساتھ ساتھ قابل عمل ہونے کی جانچ کے لیے ایک تیز اور آسان پرکھ پیش کرتا ہے۔مردہ خلیوں کی آبادی اور سیل کی کل آبادی کی وضاحت کرنے کے لئے خلیوں کو پروپیڈیم آئوڈائڈ (PI) اور Hoechst 33342 سے داغ دیا گیا تھا۔Countstar Rigel ایک ہی وقت میں GFP اظہار کی کارکردگی اور قابل عملیت کا جائزہ لینے کے لیے ایک تیز، مقداری طریقہ پیش کرتا ہے۔(شکل 4)

شکل 4: سیلز Hoechst 33342 (نیلا) کا استعمال کرتے ہوئے واقع ہیں اور GFP ظاہر کرنے والے خلیات (سبز) کا فیصد آسانی سے طے کیا جا سکتا ہے۔ناقابل عمل سیل پروپیڈیم آئوڈائڈ (PI؛ سرخ) سے داغے ہوئے ہیں۔

عملداری اور سیل کاؤنٹ

AO/PI Dual-fluoresces گنتی پرکھ کی قسم ہے جو سیل کے ارتکاز، قابل عملیت کا پتہ لگانے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔اسے سیل لائن کی گنتی اور پرائمری سیل گنتی میں مختلف سیل کی قسم کے مطابق تقسیم کیا گیا ہے۔اس محلول میں سبز فلوروسینٹ نیوکلک ایسڈ داغ، ایکریڈائن اورنج، اور ریڈ فلوروسینٹ نیوکلک ایسڈ داغ، پروپیڈیم آئوڈائڈ کا مجموعہ ہوتا ہے۔پروپیڈیم آئوڈائڈ ایک جھلی خارج کرنے والا رنگ ہے جو صرف سمجھوتہ شدہ جھلیوں والے خلیوں میں داخل ہوتا ہے جبکہ ایکریڈائن اورنج آبادی کے تمام خلیوں میں داخل ہوتا ہے۔جب دونوں رنگ نیوکلئس میں موجود ہوتے ہیں تو پروپیڈیم آئوڈائڈ فلوروسینس ریزوننس انرجی ٹرانسفر (FRET) کے ذریعے ایکریڈائن اورنج فلوروسینس میں کمی کا سبب بنتا ہے۔نتیجے کے طور پر، برقرار جھلیوں کے ساتھ نیوکلیٹیڈ خلیات فلوروسینٹ سبز رنگ کے داغ دیتے ہیں اور انہیں زندہ شمار کیا جاتا ہے، جب کہ سمجھوتہ شدہ جھلیوں والے نیوکلیٹیڈ خلیے صرف فلوروسینٹ سرخ داغ دیتے ہیں اور کاؤنٹ اسٹار ریگل سسٹم کا استعمال کرتے وقت مردہ شمار کیے جاتے ہیں۔غیر جوہری مواد جیسے کہ سرخ خون کے خلیات، پلیٹلیٹس اور ملبہ فلوریس نہیں ہوتے ہیں اور Countstar Rigel سافٹ ویئر کے ذریعہ نظر انداز کیا جاتا ہے۔(شکل 5)

شکل 5: کاؤنٹ اسٹار نے PBMC کے ارتکاز اور قابل عملیت کے سادہ، درست تعین کے لیے دوہری فلوروسینس سٹیننگ کے طریقہ کار کو بہتر بنایا ہے۔AO/PI کے ساتھ داغے ہوئے نمونوں کا Counstar Rigel کے ساتھ تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔