پیریفرل بلڈ مونو نیوکلیئر سیلز (PBMCs) کو اکثر کثافت گریڈینٹ سینٹرفیوگریشن کے ذریعے پورے خون سے الگ کرنے کے لیے پروسیس کیا جاتا ہے۔وہ خلیے لیمفوسائٹس (ٹی سیل، بی سیل، این کے سیل) اور مونوسائٹس پر مشتمل ہوتے ہیں، جو عام طور پر امیونولوجی، سیل تھراپی، متعدی بیماری اور ویکسین کی نشوونما کے میدان میں استعمال ہوتے ہیں۔طبی لیبارٹریوں، بنیادی طبی سائنس کی تحقیق اور مدافعتی خلیوں کی پیداوار کے لیے PBMC کی عملداری اور ارتکاز کی نگرانی اور تجزیہ کرنا بہت ضروری ہے۔
تصویر 1. کثافت گریڈینٹ سینٹرفیوگریشن کے ساتھ تازہ خون سے الگ تھلگ PBMC
اے او پی آئی ڈوئل فلوروسیس کاؤنٹنگ پرکھ کی قسم ہے جو سیل کے ارتکاز اور قابل عملیت کا پتہ لگانے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔حل ایکریڈائن اورنج (سبز فلوروسینٹ نیوکلک ایسڈ داغ) اور پروپیڈیم آئوڈائڈ (سرخ فلوروسینٹ نیوکلک ایسڈ داغ) کا مجموعہ ہے۔پروپیڈیم آئوڈائڈ (PI) ایک جھلی خارج کرنے والا رنگ ہے جو صرف سمجھوتہ شدہ جھلیوں والے خلیوں میں داخل ہوتا ہے، جبکہ ایکریڈائن اورنج آبادی کے تمام خلیوں میں گھسنے کے قابل ہوتا ہے۔جب دونوں رنگ نیوکلئس میں موجود ہوتے ہیں تو پروپیڈیم آئوڈائڈ فلوروسینس ریزوننس انرجی ٹرانسفر (FRET) کے ذریعے ایکریڈائن اورنج فلوروسینس میں کمی کا سبب بنتا ہے۔نتیجے کے طور پر، برقرار جھلیوں والے نیوکلیٹیڈ خلیے فلوروسینٹ سبز رنگ کے داغ دیتے ہیں اور انہیں زندہ شمار کیا جاتا ہے، جب کہ سمجھوتہ شدہ جھلیوں والے نیوکلیٹیڈ خلیے صرف فلوروسینٹ سرخ داغ دیتے ہیں اور Countstar® FL سسٹم کا استعمال کرتے وقت مردہ شمار کیے جاتے ہیں۔غیر جوہری مواد جیسے سرخ خون کے خلیات، پلیٹلیٹس اور ملبہ فلوریس نہیں ہوتے ہیں اور Countstar® FL سافٹ ویئر کے ذریعہ نظر انداز کیا جاتا ہے۔
تجرباتی طریقہ کار:
1. PBMC کے نمونے کو PBS کے ساتھ 5 مختلف ارتکاز میں پتلا کریں۔
2. 12µl AO/PI محلول کو 12µl نمونے میں شامل کریں، آہستہ سے پپیٹ کے ساتھ ملایا جائے؛
20µl مکسچر کو چیمبر سلائیڈ میں کھینچیں۔
4. خلیات کو تقریباً 1 منٹ کے لیے چیمبر میں رہنے دیں۔
5. کاؤنٹ اسٹار FL آلے میں سلائیڈ کو کیڑے لگائیں۔
6. "AO/PI Viability" پرکھ کا انتخاب کریں، پھر Countstar FL سے ٹیسٹ کریں۔
احتیاط: AO اور PI ایک ممکنہ کارسنجن ہے۔یہ تجویز کیا جاتا ہے کہ آپریٹر جلد اور آنکھوں سے براہ راست رابطے سے بچنے کے لیے ذاتی حفاظتی سامان (PPE) پہنیں۔
نتیجہ:
1. PBMC کی برائٹ فیلڈ اور فلوروسینس امیجز
AO اور PI ڈائی دونوں خلیات کے سیل نیوکلئس میں DNA کے داغ ہیں۔لہذا، پلیٹ لیٹس، خون کے سرخ خلیے، یا سیلولر ملبہ PBMCs کی حراستی اور قابل عمل نتیجہ کو متاثر کرنے سے قاصر ہیں۔زندہ خلیات، مردہ خلیات اور ملبے کو Countstar FL (شکل 1) کے ذریعے تیار کردہ تصاویر کی بنیاد پر آسانی سے پہچانا جا سکتا ہے۔
شکل 2۔پی بی ایم سی کی برائٹ فیلڈ اور فلوروسینس امیجز
PBMC کی ارتکاز اور قابل عملیت
پی بی ایم سی کے نمونوں کو پی بی ایس کے ساتھ 2، 4، 8 اور 16 بار میں پتلا کیا گیا، پھر ان نمونوں کو AO/PI ڈائی مکسچر سے لگایا گیا اور کاؤنٹ اسٹار FL نے بالترتیب تجزیہ کیا۔PBMC کے ارتکاز اور قابل عمل ہونے کا نتیجہ ذیل کی شکل میں دکھایا گیا ہے:
