بغیر لیزنگ کے پورے خون میں لیوکوائٹس کا براہ راست تجزیہ

پورے خون میں لیوکوائٹس کا تجزیہ کلینیکل لیب یا بلڈ بینک میں معمول کی جانچ ہے۔خون کے ذخیرہ کرنے کے معیار کے کنٹرول کے طور پر لیوکوائٹس کا ارتکاز اور عملداری ایک اہم اشاریہ ہے۔لیوکوائٹ کے علاوہ، پورے خون میں بڑی تعداد میں پلیٹ لیٹس، خون کے سرخ خلیے، یا سیلولر ملبے ہوتے ہیں، جس کی وجہ سے براہ راست خوردبین یا روشن فیلڈ سیل کاؤنٹر کے نیچے پورے خون کا تجزیہ کرنا ناممکن ہو جاتا ہے۔سفید خون کے خلیات کو شمار کرنے کے روایتی طریقوں میں RBC lysis کا عمل شامل ہے، جو کہ وقت طلب ہے۔

اے او پی آئی ڈوئل فلوروسیس کاؤنٹنگ پرکھ کی قسم ہے جو سیل کے ارتکاز اور قابل عملیت کا پتہ لگانے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔حل ایکریڈائن اورنج (سبز فلوروسینٹ نیوکلک ایسڈ داغ) اور پروپیڈیم آئوڈائڈ (سرخ فلوروسینٹ نیوکلک ایسڈ داغ) کا مجموعہ ہے۔پروپیڈیم آئوڈائڈ (PI) ایک جھلی خارج کرنے والا رنگ ہے جو صرف سمجھوتہ شدہ جھلیوں والے خلیوں میں داخل ہوتا ہے، جبکہ ایکریڈائن اورنج آبادی کے تمام خلیوں میں گھسنے کے قابل ہوتا ہے۔جب دونوں رنگ نیوکلئس میں موجود ہوتے ہیں تو پروپیڈیم آئوڈائڈ فلوروسینس ریزوننس انرجی ٹرانسفر (FRET) کے ذریعے ایکریڈائن اورنج فلوروسینس میں کمی کا سبب بنتا ہے۔نتیجے کے طور پر، برقرار جھلیوں کے ساتھ نیوکلیٹیڈ خلیے فلوروسینٹ سبز رنگ کے داغ دیتے ہیں اور انہیں زندہ شمار کیا جاتا ہے، جب کہ سمجھوتہ شدہ جھلیوں والے نیوکلیٹیڈ خلیے صرف فلوروسینٹ سرخ داغ دیتے ہیں اور Countstar® Rigel سسٹم کا استعمال کرتے وقت مردہ شمار کیے جاتے ہیں۔

Countstar Rigel بہت سے پیچیدہ خلیات کی آبادی کی خصوصیات کے تعین کے لیے ایک مثالی حل ہے، جو پورے خون میں سفید خون کے خلیات کا تیزی سے تجزیہ کرنے کے قابل ہے۔

تجرباتی طریقہ کار:

1.20 µl خون کا نمونہ لیں اور نمونے کو 180 µl PBS میں پتلا کریں۔
2. 12µl AO/PI محلول کو 12µl نمونے میں شامل کریں، آہستہ سے پپیٹ کے ساتھ ملایا جائے؛
20µl مکسچر کو چیمبر سلائیڈ میں کھینچیں۔
4. خلیات کو تقریباً 1 منٹ کے لیے چیمبر میں رہنے دیں۔
5. کاؤنٹ اسٹار FL آلے میں سلائیڈ کو کیڑے لگائیں۔
6. "AO/PI Viability" پرکھ کا انتخاب کریں، پھر اس نمونے کے لیے نمونہ ID درج کریں۔
7. ڈائلیشن ریشو، سیل کی قسم کو منتخب کریں، ٹیسٹ شروع کرنے کے لیے 'رن' پر کلک کریں۔

احتیاط: AO اور PI ایک ممکنہ کارسنجن ہے۔یہ تجویز کیا جاتا ہے کہ آپریٹر جلد اور آنکھوں سے براہ راست رابطے سے بچنے کے لیے ذاتی حفاظتی سامان (PPE) پہنیں۔

نتیجہ:

1. پورے خون کی روشن فیلڈ امیج

پورے خون کی روشن فیلڈ امیج میں، ڈبلیو بی سی خون کے سرخ خلیے میں نظر نہیں آتے۔(شکل 1)

تصویر 1 پورے خون کی روشن فیلڈ امیج۔

2. پورے خون کی فلوروسینس امیج

AO اور PI ڈائی دونوں خلیات کے سیل نیوکلئس میں DNA کے داغ ہیں۔لہذا، پلیٹلیٹس، خون کے سرخ خلیات، یا سیلولر ملبہ لیوکوائٹس کے ارتکاز اور قابل عمل نتیجہ کو متاثر کرنے سے قاصر ہیں۔لائیو لیوکوائٹس (سبز) اور مردہ لیوکوائٹس (سرخ) فلوروسینس امیجز میں آسانی سے دیکھے جا سکتے ہیں۔(شکل 2)

شکل 2 پورے خون کی فلوروسینس امیجز۔(ا)۔AO چینل کی تصویر؛(B) PI چینل کی تصویر؛(C) AO اور PI چینل کی تصاویر کو ضم کریں۔

3. لیوکوائٹس کی حراستی اور عملداری

Countstar FL سافٹ ویئر خود بخود تین چیمبر سیکشنز کے سیلز کی گنتی کرتا ہے اور WBC سیل کی کل گنتی (1202)، ارتکاز (1.83 x 106 سیل/ml)، اور % viability (82.04%) کی اوسط قدر کا حساب لگاتا ہے۔اضافی تجزیہ یا ڈیٹا آرکائیونگ کے لیے خون کی پوری تصاویر اور ڈیٹا کو آسانی سے پی ڈی ایف، امیج یا ایکسل کے طور پر ایکسپورٹ کیا جا سکتا ہے۔

کاؤنٹ اسٹار ریگل سافٹ ویئر کا تصویر 3 اسکرین شاٹ