Tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) thường được xử lý để tách khỏi máu toàn phần bằng cách ly tâm gradient tỷ trọng.Những tế bào đó bao gồm tế bào lympho (tế bào T, tế bào B, tế bào NK) và tế bào đơn nhân, thường được sử dụng trong lĩnh vực miễn dịch học, liệu pháp tế bào, bệnh truyền nhiễm và phát triển vắc-xin.Theo dõi và phân tích khả năng tồn tại và nồng độ của PBMC là rất quan trọng đối với các phòng thí nghiệm lâm sàng, nghiên cứu khoa học y tế cơ bản và sản xuất tế bào miễn dịch.
Hình 1. PBMC được phân lập từ máu tươi với ly tâm gradient tỷ trọng
Đếm huỳnh quang kép AOPI là loại xét nghiệm được sử dụng để phát hiện nồng độ và khả năng sống sót của tế bào.Dung dịch là sự kết hợp của acridine da cam (vết axit nucleic huỳnh quang màu xanh lá cây) và propidium iodide (vết axit nucleic huỳnh quang màu đỏ).Propidium iodide (PI) là thuốc nhuộm loại trừ màng chỉ xâm nhập vào các tế bào có màng bị tổn thương, trong khi acridine cam có thể xâm nhập vào tất cả các tế bào trong quần thể.Khi cả hai chất nhuộm đều có mặt trong nhân, propidium iodide gây ra sự giảm huỳnh quang màu da cam của acridine bằng cách truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET).Kết quả là các tế bào có nhân có màng nguyên vẹn nhuộm màu xanh lục huỳnh quang và được tính là sống, trong khi các tế bào có nhân có màng bị tổn thương chỉ nhuộm màu đỏ huỳnh quang và được tính là đã chết khi sử dụng hệ thống Countstar® FL.Vật liệu không có nhân như tế bào hồng cầu, tiểu cầu và mảnh vụn không phát huỳnh quang và bị phần mềm Countstar® FL bỏ qua.
Quy trình thí nghiệm:
1. Pha loãng mẫu PBMC thành 5 nồng độ khác nhau với PBS;
2. Thêm 12µl dung dịch AO / PI vào 12µl mẫu, trộn nhẹ bằng pipet;
3. Vẽ hỗn hợp 20µl vào lam kính;
4 Cho phép các tế bào lắng trong buồng khoảng 1 phút;
5. phát hiện slide vào thiết bị Countstar FL;
6.Chọn xét nghiệm “Khả năng tồn tại của AO / PI”, sau đó kiểm tra bằng Countstar FL.
Thận trọng: AO và PI là chất có khả năng gây ung thư.Người vận hành khuyến cáo nên đeo thiết bị bảo hộ cá nhân (PPE) để tránh tiếp xúc trực tiếp với da và mắt.
Kết quả:
1. Hình ảnh trường sáng và huỳnh quang của PBMC
Thuốc nhuộm AO và PI đều nhuộm DNA trong nhân tế bào của tế bào.Do đó, tiểu cầu, hồng cầu hoặc mảnh vụn tế bào không thể ảnh hưởng đến nồng độ và khả năng sống sót của PBMCs.Các tế bào sống, tế bào chết và mảnh vụn có thể được phân biệt dễ dàng dựa trên hình ảnh được tạo ra bởi Countstar FL (Hình 1).
Hình 2． Hình ảnh trường sáng và huỳnh quang của PBMC
2.Tập trung và khả năng tồn tại của PBMC
Các mẫu PBMC được pha loãng trong 2, 4, 8 và 16 lần với PBS, sau đó các mẫu này được ủ với hỗn hợp thuốc nhuộm AO / PI và được phân tích bằng Countstar FL tương ứng.Kết quả về nồng độ và khả năng tồn tại của PBMC được thể hiện như hình dưới đây:
